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【摘要】 目的建立抗脑衰胶囊中葛根素和2,3,5,4'四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷的含量测定方法。方法采用反相高效液相色谱法，色谱柱为Nova-Pak C18(150 mm×3.9 mm，4 μm)，流速0.8 ml·ml-1，乙腈∶水（20∶80）为流动相，检测波长为320 nm。结果葛根素的线性范围为0.3056～1.528 mg·ml-1，r=0.999 7，平均回收率为98.15%，RSD＝1.20%（n=6）；2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的线性范围为1.024～8.192 μg·ml-1，r=0.999 5，平均回收率为97.46%，RSD＝2.12%（n=6）。结论该方法简便、快速、准确，适合该胶囊中葛根素和2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷的含量测定。
【关键词】 反相高效液相色谱法 葛根素 2,3,5,4' 四羟基二苯乙烯 2 Oβ D 葡萄糖苷
Abstract:ObjectiveTo establish a method for the determination of puerarin and 2,3,5,4'-Tetrahydroxy-stibene2OβDglycoside in Kangnaoshuai capsule. MethodsRPHPLC was conducted on a waters Nova-PakC18 column(4 μm,150 mm×3.9 mm)with acetonitrile-water(20:80), the flow rate was 0.8 ml·ml-1, the detection wavelength was 320nm. ResultsThe linear range was 0.3056～1.528 mg·ml-1(r=0.999 7)，the average recovery was 98.15%, RSD=1.20%(n=6)for puerarin and the linear range was 1.024～8.192 μg·ml-1(r=0.999 5)，the average recovery was 97.46%, RSD=2.12%(n=6) for 2,3,5,4'-Tetrahydroxy-stibene-2-O-β-D-glycoside. Conclusion The method is simple, sensitive, accurate and suitable for the determination of puerarin and 2,3,5,4'-Tetrahydroxy-stibene-2-O-β-D-glycoside in Kangnaoshuai capsule.
Key words:RP-HPLC； Puerarin ； 2,3,5,4'-Tetrahydroxy-stibene-2-O-β-D- glycoside
抗脑衰胶囊是由何首乌、葛根、熟地黄、人参、枸杞子等多味中药组成，具有益气养血、补肾填精、强身健脑等功效，临床主要用于肝气血亏所引起的头晕目眩、精神疲惫等症状。为了有效地控制产品质量，保证临床用药安全有效，本文选择葛根中的葛根素和何首乌中的2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷作为质控指标，用反相高效液相色谱法同时测定其含量［1，2］。现报道如下。
1 仪器与试药
美国Waters 600型四元液相色谱泵，Waters996型光电二极管阵列检测器，WatersM32色谱工作站。抗脑衰胶囊(石家庄四药股份有限公司，批号050302；050508；050611)，抗脑衰胶囊阴性样品（本院自制），葛根素对照品(中国药品生物制品检定所,0752-9905,经面积归一化法测定含量在99.03%以上)，2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品（中国药品生物制品检定所，0844－200003），乙腈（上海生生化工助剂厂，色谱纯，批号200108253），水为重蒸水，其余所用试剂均为分析纯。所有试剂和样品均经0.45 μm的滤膜过滤。
2 方法和结果
2.1 色谱条件 Waters Nova-PakC18色谱柱（3.9 mm×150 mm，4 μm），流动相为乙腈∶水（20∶80），流速为0.8 ml·min-1，柱温40℃，检测波长320 nm。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取葛根素对照品15.28mg置5 ml量瓶中，加30%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为3.056 mg·ml-1的葛根素对照品溶液；精密称取2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品5.12 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.0512 mg·ml-1的2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液。
2.2.2 样品溶液的制备 取抗脑衰胶囊20粒,倾取内容物，研细，精密称取细粉1.0 g，置干燥锥形瓶中，加入甲醇适量，超声30 min，室温下过滤，滤液置80℃水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10 ml，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.2.3 阴性样品溶液制备 按处方配制不含葛根、何首乌的阴性样品，按“2.2.2”项操作方法制备阴性样品溶液。
2.3 干扰性实验 取葛根素对照品溶液、2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液、样品溶液、阴性样品溶液各5μl，在上述色谱条件下进样测定。结果见图1。由图1可知样品中的其他组分不干扰葛根素和2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的测定。
2.4 线性关系实验
2.4.1 葛根素 分别精密吸取葛根素对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，分别置于2 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，按上述色谱条件，依次进样10 μl，测定峰面积，将所得峰面积与进样量进行线性回归，回归方程为Y=2.188×107X-1.191×106(r=0.999 7)。结果表明葛根素在0.305 6～1.528 mg·ml-1范围内线性关系良好。
图1 抗脑衰胶囊高效液相色谱图（略）
2.4.2 2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷 分别精密吸取2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 ml置25 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，按上述色谱条件，依次进样10 μl，测定峰面积，将所得峰面积与进样量进行线性回归，回归方程为Y=6.136×106X-1.787×103(r=0.999 5)。结果表明2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在1.024～8.192 μg·ml-1范围内线性关系良好。
2.5 精密度实验 取浓度为0.916 8 mg·ml-1的葛根素对照品溶液，重复进样6次，10 μl/次，结果峰面积RSD为0.86%（n=6）；取浓度为0.051 2 mg·ml-1的2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液，重复进样6次，10 μl/次，结果峰面积RSD为1.16%（n=6）。
2.6 重现性实验 取同一批号样品6份，按样品溶液的制备方法进行测定，结果葛根素峰面积RSD为1.58%；2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰面积RSD为1.28%，表明此方法重现性良好。
2.7 加样回收实验 精密称取6份已知含量的样品1.0 g，精密加入浓度为3.056 mg·ml-1的葛根素对照品溶液1.0 ml和浓度为0.051 2 mg·ml-1的2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液1.0 ml，按“2.2.2”项中自“加入甲醇适量”起进行操作，进样10 μl测定。结果见表1～2。
表1 葛根素回收率实验结果（略）
表2 2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷回收率试验结果（略）
2.8 样品测定按样品溶液的制备方法对3批样品进行测定，结果见表3。
表3 样品含量测定结果（略）
3 讨论
本实验曾参考有关文献资料［2，3］进行测定。结果表明采用甲醇作为提取溶剂，能很好地避免该胶囊中其他成分的干扰，被测组分分离良好。
实验中将样品分别超声20，30，40 min后测定葛根素和2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量，结果表明，超声20 min时测得的两者含量偏低，而超声30 min和40 min后测得的两者含量无明显差别，故本实验确定超声时间为30 min。
本方法操作简便，灵敏度高，结果准确，可作为该品种实际生产中质量控制的标准。
【参考文献】
［1］ 国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社, 2005：122
［2］ 林少华，赫玉芳，南敏伦，等. 高效液相色谱法测定降脂减肥颗粒中葛根素的含量［J］.时珍国医国药，2006，17（2）：205.
［3］ 蒋 琴，鞠建明，鲁 静.养血生发胶囊中何首乌羟芪衍生物的含量测定［J］.时珍国医国药，2001，12（9)：786.