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【摘要】目的建立反相高效液相色谱法同时测定龙胆花中落干酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷的含量。方法采用ZORBAX SB－CM18（250 mm×4.6 mm,5 μm）色谱柱；流动相甲醇和水（含0.04%磷酸）为15∶85的比例洗脱；检测波长为238 nm；流速1 ml·min-1；柱温30℃。结果4种成分均达到基线分离，落干酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷的线性范围分别为0.10～6.25 μg (r =0.999 9)，0.076～3.5 μg (r =0.999 8)，0.04～5.65 μg(r = 0.999 9)和1.27～7.62 μg (r =0.999 8)；平均回收率分别为99.2％(RSD=2.6％,n=5)，103.0％(RSD=1.5％,n=5)，101.0％(RSD=1.1％,n=5)，99.7％ (RSD=3.6％,n=5)。结论该方法测定快速，结果准确、可靠。
【关键词】 反相高效液相色谱 落干酸 獐牙菜苦苷 龙胆苦苷 獐牙菜苷 龙胆花
Abstract：ObjectiveTo establish a quantitative method of simultaneous determination of loganic acid,swertiamarin ,gentiopicroside and sweroside in Gentiana veitchiorum Hemsl by RP-HPLC.MethodsThe sample was separated on the column of Zorbax S-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) and eluted with methanol and water(0.04％ phosphoric acid) to 15:85,the detection wavelength was at 238 nm, the flow rate was 1ml·min-1，and the column temperature was at 30℃.ResultsFour compounds were isolated．The linear ranges of loganic acid，swertiamarin，gentiopicroside and sweroside were 0.10～6.25 μg (r=0．999 9)，0.076～3.5μg (r=0.999 8)，0.04～5.65μg(r= 0．999 9) and 1.27～7.62 μg (r=0.999 8) respectively. The average recoveries were 99.2％(RSD=2.6％, n=5)，103.0％(RSD=1.5％,n=5)，101.0％(RSD=1.1％, n=5) and 99.7％ (RSD=3.6％,n=5,) ，respectively.ConclusionThe method is rapid and precise .
Key words：RP-HPLC; Loganic acid; Swertiamarin; Gentiopicroside; Sweroside; Gentiana veitchiorum Hemsl
藏药龙胆花为龙胆科植物蓝玉簪龙胆Gentiana veitchiorum Hemsl的花，藏名“榜间”，具有清湿热、泻肝胆实火、镇咳、利喉、健胃功能,主治感冒发烧、目赤咽痛、肺热咳嗽、胃炎、脑膜炎、尿道炎、气管炎、阴痒及阴囊湿疹、天花等［1］。
龙胆花主要含有裂环环烯醚萜苷类活性成分，如落干酸（loganic acid）、獐牙菜苦苷(swertiamarin)、龙胆苦苷(gentiopicroside)和獐牙菜苷(sweroside)等［2］。龙胆花常作为藏成药的君药或臣药，如龙胆花丸、十五味龙胆丸、三味龙胆丸等，对龙胆花及制剂中的活性成分的测定只有龙胆苦苷［3］，而对龙胆花的龙胆苦苷及上述3种活性成分同时测定的方法尚未见报道。本文利用高效液相色谱（HPLC）法同时测定了龙胆花中上述4种有效成分的含量，为全面评价龙胆花及藏成药质量提供更科学的依据。
1 仪器与试剂
Agilent1100高效液相色谱仪（配置：手动进样器、在线脱气机、高压二元梯度泵、恒温柱温箱、DAD检测器，Agilent1100色谱工作站）、ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）色谱柱；KQ3200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
獐牙菜苦苷、龙胆苦苷对照品购自中国药品生物制品检定所；落干酸、獐牙菜苷对照品由本实验室自行分离得到，经归一化法测定，纯度大于98％；甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为自制三重蒸馏水。
龙胆花2007-08采于青海省果洛州玛沁县，由青海普兰特藏药研究所孙洪发研究员鉴定，阴干后粉碎过80目筛，冷藏保存。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为ZORBAX SB－C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流动相为甲醇∶水（含0.04%磷酸）为15∶85；流速1 ml·min-1；检测波长238 nm；柱温30℃。该色谱条件下落干酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷4种成分均被洗脱且达到基线分离。色谱图见图1。
2.2 对照品溶液的制备
分别精密称取适量的落干酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷对照品，用甲醇溶解，置10 ml的容量瓶中定容，摇匀作对照品溶液备用。使用时稀释为所需浓度。
2.3 供试品溶液的制备精密称取粉碎至80目的样品0.5 g，加入甲醇15 ml，超声提取40 min，抽滤，以甲醇洗涤滤渣两次，1 ml/次。重复上述操作，所得滤液与前一次滤液合并，浓缩后，用甲醇定容于50 ml容量瓶中。过0.45 μm滤膜，在选定色谱条件下测定有效成分的含量。
2.4 线性关系考察
分别精密量取适量4种对照品储备液，置2 ml容量瓶中，用甲醇定容于刻度，得混合对照品标液系列溶液。取混合对照品标液系列溶液分别进样10 μl，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，各组分进样量(μg)与峰面积A的线性方程及相关系数见表1。表1 4种活性成分的线性方程及线性范围（略）
2.5 检测限
在选定的色谱条件下，当信噪比S/N＝3时，对各组分最低检测限进行测定，结果表明，落干酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷的最低检测限分别为0.56，0.25，0.45，0.84 ng。
2.6 精密度实验按“2.1”项下的色谱条件，取10 μl混合对照品溶液进样，测定色谱峰的峰面积，计算得4种活性成分的RSD分别为0.93%，0.81%，0.56%和1.2%(n=5)，表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性实验精密称取样品0.5 g，按“2.1”项下的色谱条件，分别于当日、次日及第3天进样分析，测定落干酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷的峰面积，计算得RSD分别为1.2%，1.6%，1.3%和2.1%，表明供试品溶液3 d内稳定。
2.8 重复性实验
精密称取龙胆花粗粉（80目）6份，按“2.3”项下的方法，制备成供试品溶液。按“2.1”项下的色谱条件，进样分析，记录峰面积，按回归方程计算组分含量，得落干酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷的RSD分别为0.87%，1.11%，1.87%和1.75%。
2.9 回收率实验精密称取已知含量的龙胆花粗粉5份，分别加入一定量的混合对照品溶液，照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，落干酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷的平均回收率分别为99.2％(RSD=2.6％)，103.0％(RSD=1.5％)，101.0％(RSD=1.1％)和99.7％ (RSD=3.6％)。
2.10 样品含量的测定
取“2.3”项下制备的样品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行分析，经DAD检测器检测上述4种待测组分的峰纯度且其紫外光谱与对照品一致后，按外标法以峰面积积分值计算，得4种有效成分的含量(每个样品重复进样5次，取平均值)分别为1.16%，0.15%，5.47%和3.86%。
3 讨论
3.1 检测波长的确定
将落干酸、獐牙苦苷、龙胆苦苷和獐牙苷对照品溶液在200～400 nm范围内进行扫描,结果在254 nm及238 nm附近均有吸收。在238 nm杂质干扰少,故选择238 nm为检测波长。
3.2 提取方法确定
实验考察了甲醇回流提取法和超声提取等条件下的提取率,结果显示回流提取时裂环环烯醚萜苷类活性成分部分被破坏，故采用超声提取。超声提取时考察了药材的粉碎度以及不同溶剂下不同时间内的提取率,结果提示过80目筛后甲醇超声提取两次，每次40 min，提取完全。
3.3 流动相的选择在筛选裂环环烯醚萜苷类活性成分测定的色谱条件过程中,曾尝试过用不同比例的甲醇和水作为的流动相，发现甲醇-水（0.4%磷酸）为15∶85，4种成分均被洗脱且达到基线分离。
所建方法具有提取、分析方法简便、快速、结果准确可靠等特点，对全面评价龙胆花及其藏成药质量有重要的作用。
【参考文献】
［1］中国科学院西北高原生物研究所.藏药志［M］.西宁：青海人民出版社，1991：188.
［2］北京医学院，北京中医学院.中草药成分化学［M］.北京：人民卫生出版社，1884：344.
［3］刘 圆，孟庆艳，彭镰心，等.RP-HPLC 法测定藏药龙胆花的两种原植物白花龙胆和蓝玉簪龙胆中龙胆苦苷［J］.中草药，2006,37(11):1738.