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【摘要】目的建立测定蒲薏颗粒中咖啡酸含量的方法。方法 色谱柱Lichrospher C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-水-磷酸（7∶100∶0.1）为流动相，检测波长：323 nm, 柱温：40℃,流速：1 min·ml-1。结果咖啡酸在0.005 3～0.848 mg·ml-1 范围内线性关系良好(r= 0.999 9)；平均加样回收率为97.75%，RSD=2.88%。结论该方法操作简便，结果准确，适用于蒲薏颗粒中咖啡酸的含量测定。
【关键词】 咖啡酸 蒲薏颗粒 反相高效液相色谱
蒲薏颗粒是由蒲公英、生薏苡仁、生何首乌、灵芝、三棱组成的复方制剂，具有清热解毒、活血化瘀、补益气血之功效。用于消化道肿瘤的放疗、化疗的辅助治疗，临床适宜病证见皮肤红斑、色素沉着、脱发、恶心、呕吐、口舌生疮、精神疲惫、面色无华，舌红偏紫，舌苔薄腻，脉弦细数等热毒炽盛、血行瘀滞、气血不足者，也可用于消化道肿瘤非放、化疗时而见上述证情者。蒲公英为蒲薏颗粒中的主药，而《中国药典》2000年版收载的蒲公英含量测定指标成分为咖啡酸。为控制产品质量，我们对制剂中咖啡酸的含量测定方法进行了研究。
1 仪器与试药
1.1 仪器高效液相色谱仪系统（岛津LC-10Avp），包含2台LC-10ATvp泵；SPD-10Avp紫外检测器，7725i手动进样阀，TC-100柱温箱（天津特纳科技公司），WML色谱工作站（广西威玛龙色谱科技公司）；超声波清洗器（250 W，29～34 kHz；北京医疗设备二厂）；METTLER AE240电子天平［梅特勒-脱利多仪器（上海）有限公司］等。
1.2 试药
咖啡酸对照品购自中国药品生物制品检定所（批号：885-200102；规格：供含量测定用）。乙腈（色谱纯），甲醇、磷酸、氯仿等为分析纯。蒲薏颗粒由贵阳医学院药物研究所提供（批号：20030306，20030310，20030312）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱为Lichrospher C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水-磷酸（7∶100∶0.1）；检测波长323 nm［1］；柱温40℃；流速1.0 mg·ml-1 ；进样量10 μl；咖啡酸的保留时间(tR)约为25 min。
2.2 对照品溶液的制备精密称取咖啡酸对照品10.60 mg，置100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制得每毫升含0.106 0 mg的对照品储备液。
2.3 供试品溶液的制备取装量差异项下的样品，研细，取约2.0 g，精密称定，精密加水25 ml，超声处理（250 W，29～34 kHz）20 min，摇匀，离心，取上清液5 ml置干燥的离心试管中，加氯仿5 ml，密塞，漩涡混合5 min，离心，取上清液用滤膜（0.45 μm）滤过，即得。
2.4 阴性溶液的制备按处方比例和生产方法制成缺蒲公英的样品，按“2.3”项下供试品溶液的制备方法制成阴性溶液。
2.5 干扰性实验分别取咖啡酸对照品溶液、制剂供试品溶液及缺蒲公英药材的阴性对照液各10 μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，结果供试品色谱与对照品色谱相应的保留时间处有吸收峰，而阴性溶液无吸收峰，说明阴性无干扰。见图1。
2.6 线性关系考察精密吸取上述咖啡酸对照品储备液0.5，1，2，4，8 ml分别置10 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得系列对照品工作液。分别精密吸取上述系列对照品工作液各10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱，以峰面积Y为纵坐标，进样浓度X（mg·ml-1）为横坐标，得回归方程为Y＝44 000 097X-25 772，r= 0.999 9，在0.005 3～0.848 mg·ml-1范围内，进样浓度与峰面积呈良好的线性关系。
2.7 精密度实验精密吸取咖啡酸对照品溶液（0.010 60 mg·ml-1）10 μl注入色谱仪，重复进样5次，测定咖啡酸，结果咖啡酸平均峰面积为438 974，RSD为1.47%。
2.8 稳定性实验取同一供试品溶液10 μl，分别于0，1，2， 4，8 h进样测定峰面积，结果供试品溶液中咖啡酸在4 h内稳定不变。
2.9 重复性实验取同一批号样品供试品，按供试品溶液制备方法制备5份供试品溶液，分别进样测定，结果样品中咖啡酸的平均含量为0.095 2 mg·g-1，RSD为2.81%。
2.10 回收率实验采用加样回收法。精密称取已测定含量的同一批样品（平均含量0.095 2 mg·g-1）5份，精密加入咖啡酸对照品适量，按制剂供试品溶液制备方法制备5份供试液，分别进样10 μl。结果见表1。表1 制剂供试品中咖啡酸的回收率实验（略）
2.11 样品的测定分别精密吸取咖啡酸对照品溶液和供试品溶液适量，经0.45 μm微膜过滤，分别进样10 μl，测定，计算蒲薏颗粒中咖啡酸的含量。结果见表2。
表2 蒲薏颗粒咖啡酸的含量测定结果（略）
3 讨 论
3.1 供试品溶液制备方法的选择制剂中蒲公英药材已经过提取，其中咖啡酸以游离形式存在，根据咖啡酸溶解于水、甲醇、乙醇等性质［2，3］，在样品提取中，分别考察了水、不同浓度的甲醇为提取溶剂，结果以水为提取溶剂的效果较好。水提取液经氯仿除杂进样和酸化后用醋酸乙酯提取等方法实验，后者回收率偏低。用氯仿提取后的水溶液测定时杂质干扰较小，回收率高。以水为提取溶剂，分别超声处理不同时间后，用氯仿提取，将水溶液直接进样分析，实验结果表明，超声处理20 min可将制剂中咖啡酸提取完全，故制剂采用水超声处理20 min，氯仿除杂的水溶液作为供试品溶液。
3.2 色谱条件的选择分别采用了Kromasil C18（5 μm，200 mm×5 mm）、Diamonsil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）和Lichrospher C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）色谱柱，分别以甲醇-磷酸盐缓冲溶液、乙腈-0.1%磷酸为流动相，结果以乙腈-水-磷酸（7∶100∶0.1），Lichrospher C18色谱柱，柱温40℃，分离效果较好。
【参考文献】
［1］国家药典委员会.中国药典， Ⅰ部［S］. 北京：化学工业出版社，2000:289.
［2］国家医药管理局中草药情报中心站.植物药有效成分手册［M］.北京：人民卫生出版社，1986：161.
［3］肖培根.新编中药志，第1卷［M］.北京：化学工业出版社，2000：519.