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【摘要】目的建立甘草中甘草查尔酮A的含量测定方法。方法采用高效液相色谱（HPLC）法，使用Hypersil ODS2色谱柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm），以甲醇-水-冰醋酸（60∶40∶1）为流动相，流速1.0 ml·min-1, 检测波长为372 nm，柱温 25℃。结果甘草查尔酮A线性范围0.2～1.0 μg, r=0.999 2；精密度实验RSD为1.51 %；重复性实验RSD为2.54 %；稳定性实验RSD为1.72 %；平均加样回收率98.76 %，RSD=1.94 %。结论该方法灵敏、准确，重复性好，可作为甘草中甘草查尔酮A的含量测定方法。
【关键词】 甘草 甘草查尔酮A 高效液相色谱法
Abstract：ObjectiveTo establish a determination method of licochalcone A in Licorice. MethodsUsing HPLC method, the system consisted of Hypersil ODS2 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm),mobile phase of methanol-water- glacial acetic acid (60∶40∶1) mixture, with a flow rate of 1.0 ml·min-1; detection wavelength was at 372 nm column temperature of 25 ℃. ResultsLinear range was 0.1～1.0 μg with the r of 0.999 2,precision test ,repeation test ,and stability test were 1.51%,2.54% and 1.72%,respectively .The mean recovery was 98.76 %, with respectively RSD of 1.94 %. ConclusionThe methoed is sensitive, accurate and with good reproducibility and can be used as the determination method of licochalcone A.
Key words：Licorice; Licochalcone A; HPLC
药用甘草为豆科植物乌拉尔甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.，胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根茎，是多年生药用草本植物。植化研究表明甘草中存在大量的酚类成分，这些具有生物活性的成分有望成为开发新药的来源［1］。甘草查尔酮A(licochalcone A)是存在于甘草中的一种酚类查尔酮化合物［2］，临床及药理研究表明，甘草查尔酮A具有抗氧化［3］、抗炎［4］、抗菌［5］、抗肿瘤［6］、抗利什曼原虫病［7］、免疫促进和雌激素样［8］等活性，在临床上具有广泛的应用前景，但有关其含量测定的方法还未见报道。本文建立了甘草查尔酮A的HPLC含量测定方法，为进一步开发甘草中这一重要活性成分提供简便可行的检测方法。
1 仪器与试剂
美国Agilent 1100液相色谱仪系统；KQ-100DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
甘草由新疆昆仑神农有限公司赠送，经新疆甘草种植中心鉴定分别为乌拉尔甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.，胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.和光果甘草Glycyrrhiza glabra L.。甘草查尔酮A对照品，本实验室自制，经质谱、碳谱和氢谱鉴定为甘草查尔酮A(licochalcone A), 归一化测定含量为98.81%。乙腈、甲醇为色谱纯；水为重蒸水；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液的制备准确称取在60℃干燥至恒重的甘草查尔酮A对照品适量，用流动相配成浓度为0.1 mg·ml-1的对照品储备液，待用。
2.1.2 供试品溶液的制备准确称取干燥恒重甘草粉末（过60目筛）0.5 g，置100 ml具筛锥形瓶中，加入甲醇25 ml，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）30 min，过滤，再加入甲醇20 ml，超声处理30 min，合并滤液，减压浓缩至干，加流动相溶解并定容至50 ml，微孔滤膜(0.45 μm)过滤，即得供试品溶液。
2.2 色谱条件
色谱柱为大连依利特 Hypersil ODS2 C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；柱温25℃；流动相为甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1)；检测波长372 nm；流速1.0 ml·min-1。
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系考察
准确吸取甘草查尔酮A对照品储备液2，4，6，8，10 ml分别置于5个10 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度。分别吸取上述对照品溶液各10 μl，依次注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以浓度C(μg/ml)为横坐标，色谱峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：A=41 308 C-142 057，r=0.999 2， 线性范围为：0.2～1.0 μg。
2.3.2 精密度实验
准确吸取浓度为100 μg·ml-1的甘草查尔酮A标准品溶液10 μl，重复进样5次，测得峰面积值，计算相对标准偏差RSD为1.51%，说明仪器良好。
2.3.3 重复性实验
准确称取同一批次的胀果甘草5份，按“2.1.2”项下制备样品溶液，依次测定，根据标准曲线换算甘草查尔酮A的含量，计算甘草查尔酮A含量的RSD为2.54%，表明实验方法重复性较好。
2.3.4 稳定性实验
取同一份待测供试品溶液，在0, 2, 4, 8, 12 h进样测定，测得甘草查尔酮A峰面积值并计算样品峰面积的RSD为1.72%，表明供试品溶液于12 h内稳定。
2.3.5 加样回收率实验
准确称取已知含量的样品约0.1 g(共5份)，精密加入0.10 mg/ml的甘草查尔酮A标准品1 ml，按“2.1.2”项下方法制备所需溶液，测定并计算含量。表1结果表明甘草查尔酮A平均回收率为98.76 %，RSD为1.94 %。表1 样品加样回收率实验结果（略）
2.4 样品测定
按照本方法的测定条件，分别测定《中国药典》收录的3种甘草样品，计算甘草查尔酮A的含量，结果见表2。甘草查尔酮A标准品及样品HPLC图谱见图1～2。表2 甘草查尔酮A含量测定结果（略）
3 讨论
3.1 色谱条件选择
比较了乙腈-水(60∶40)、甲醇-水(70∶30)、甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1)、乙腈-甲醇-水(40∶30∶30)等流动相体系，结果第3种流动相分离效果最好，所以，本文选用甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1)为流动相。
3.2 溶液制备方法
比较了不同提取溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）和提取方法（回流提取，索氏提取，超声提取）的提取效果，结果表明甲醇对甘草查尔酮A的提取效果优于其他两种溶剂，索氏提取和超声提取的效果相当，均优于回流提取，但索氏提取耗时较长，故本文以甲醇为提取剂采用超声提取制备样品供试溶液。
3.3 检测波长的选择在200～700 nm之间对甘草查尔酮A对照品溶液进行光谱扫描，结果表明在372 nm处有极大吸收，故选择372 nm为检测波长。
结果表明该方法简单，快捷，专属性强，准确度高，具有良好的重复性，可用于甘草中甘草查尔酮A的含量测定。
【参考文献】
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