高效液相色谱法测定诃子中鞣花酸的含量

　　【摘要】 目的建立诃子提取物中鞣花酸含量的高效液相色谱(HPLC)测定方法。方法色谱条件Shim-pack CLC-ODS色谱柱(150 mm×6 mm，5 μm)，柱温30℃,用CH3OH-EtOAc-KH2PO4/H3PO4(0.05 mol/L)(体积比30∶2∶68)作为流动相,检测波长为254 nm。结果鞣花酸在0.268～5.36 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。平均加样回收率为98.42%,RSD为1.13%(n=5)。结论该方法快速、简便、准确，可用于诃子中鞣花酸的含量测定。

　　【关键词】  诃子; 鞣花酸; 高效液相色谱

　　Abstract：ObjectiveTo develop an HPLC method for the determination of ellagic acid in the extract of Terminalia .MethodsHPLC separation was carried out in an Shim-pack CLC-ODS columm (150 mm×6 mm，5μm)with the mobile phase consisted of methanol ethyl acetate, 0.05 mol/L KH2PO4-H3PO4(34∶2∶64) at a flow rate of 1.0 ml/min. The detection wavelength was 254 nm. ResultsThe linear range was 0.268～5.36 μg/ml for ellagic acid. The average recovery was 98.42% , and RSD was 1.13% ( n=5).ConclusionThis method is rapid, accurate and reproducible for determination of ellagic acid in the extract of Terminalia.

　　Key words： Terminalia; Ellagic acid; HPLC

　　诃子Terminalia chebula Rotz.又名诃黎、诃黎勒、随风子，为使君子科植物的果实[1]。 诃子作为中药在中医临床上广泛使用，用于油脂抗氧化方面的研究在国内已见有专门报道[2]。诃子果实中含丰富的鞣质和多元酚类，约为30%～40%[3]已有文献报道，鞣质和多元酚类具有较好的抗氧化性[4]。

　　鞣花酸(2，3，7，8-tetrahydroxy benzopyrano[5， 4，3-cde]benzopyran-5，10-dione) 是一种植物多酚类化合物[5](如图1)，为诃子中主要的活性成分之一，广泛存在于各种自然的软果、坚果等植物果实中。它对化学物质诱导癌变及其他多种癌变有明显的抑制作用，它能与人体内有害自由基结合，具有强力祛癌变功效，可以抗衰老、增加机体免疫， 还具有降压、镇静作用，对多种细菌、病毒有很好的抑制作用[6]。因此鞣花酸有“克癌之星”“致癌物清除剂”之美称。从机理上讲， 鞣花酸是一种抗氧化剂[7]，它可作为保健食品添加剂，研究、开发本品具有较高的经济价值和广泛的应用范围。

　　本实验建立了HPLC法测定诃子中鞣花酸含量的方法，并对文献报道的多种色谱条件进行了比较[8～10]，表明本文方法精确可行。

　　1 仪器与试剂

　　日本岛津SPD-10AT高效液相色谱仪; SPD-10Avp检测器;SIL-10AP自动进样器;超纯水器(arium 611UF，Sartorius);超声波清洗器(AS3120A，天津瑞森特);电子天平(AdventurerTM，AR2140，上海奥豪斯公司); 旋转蒸发仪(R-200，瑞士Buchi)。岛津UV2100型，甲醇为色谱纯;实验用水为超纯水，蒸馏水自制，其它试剂均为国产分析纯试剂。

　　鞣花酸对照品(购自购自成都普瑞法科技开发有限公司),纯度≥98%。诃子(产自云南临仓和缅甸)。

　　图1 鞣花酸的结构

　　2 方法

　　2.1 色谱条件色谱柱为岛津Shim-pack CLC-ODS柱(150 mm×6 mm，5 μm)， 柱温30℃，用CH3OH-EtOAc-KH2PO4/H3PO4(0.05 mol/L)(体积比34∶2∶64)作为流动相，检测波长为254 nm。

　　2.2 对照品溶液的制备精密称取鞣花酸对照品6.7 mg，加甲醇25 ml制成每毫升含0.268 mg的对照品溶液。

　　2.3 供试品溶液的制备精密称取诃子粉 (均过60目筛)约1 g，置于100 ml具塞三角烧瓶中，加60%乙醇25 ml，超声提取60 min，过滤，用60%洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液， 50℃旋转蒸干，加甲醇定容至10 ml，以0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液作为样品供试液，进样10 μl。

　　2.4 标准曲线制备精密吸取对照品溶液1.0，2.0，5.0，10.0，15.0，20.0 μl进样，测定峰面积，并以色谱峰峰面积(A)对对照品的量(m)回归(包括原点)，得回归方程为A= 7.577 7E+06 m + 9.670 0E+05(R=0.999 9)。鞣花酸0.268～5.36 μg范围内，线性关系良好。

　　2.5 精密度和样品重复性实验重复进对照品溶液10 μl/次，测得鞣花酸峰面积相对标准偏差RSD=0.9%(n=6);对同一样品按拟定的方法作多次测定，其含量相对标准偏差RSD=2.1%(n=5)。

　　a-鞣花酸对照品 b-诃子样品

　　图2 对照品和样品色谱图

　　2.6 回收率实验采用加样回收法取已知量的诃子，分别添加一定量的鞣花酸对照品，按拟定的方法测定，结果平均回收率为98.42%,RSD为1.13%(n=5)。

　　2.7 样品测定 按上述“2.3”项样品液制备方法测定云南产诃子和缅甸产诃子中鞣花酸的含量,云南产诃子和缅甸产诃子的鞣花酸含量分别为0.573 mg/g(RSD=3.4 %)和0.567 mg/g(RSD=4.2%)。

　　3 结果

　　3.1 最佳检测波长的选择对鞣花酸对照品甲醇溶液的紫外-可见光( 200～600 nm)扫描发现，鞣花酸在254 nm有最大吸收，故选择254 nm为其检测波长。

　　3.2 流动相的选择实验发现，若仅用甲醇和水作流动相，很难实现多酚物质的分离。通过改变流动相的 pH 值来提高分离度，由于 pH 太低会损坏色谱柱，导致柱效降低。本实验选用磷酸和磷酸盐缓冲体系，醋酸乙酯和甲醇作流动相，流动相中加入了一定量的磷酸，对鞣花酸起离子抑制作用，使其与杂质峰达到很好地分离。

　　3.3 流速对分离度的影响在一定流速范围内，流速减少，柱效提高，分离度变大。但若流速过慢，分析时间延长，纵向扩散的影响变大，柱效降低。虽然提高流速可缩短分析时间，但若流速过高，物质来不及分离就被洗出，分离效果差，而且会损坏泵头和色谱柱。因此，流速对分离度的影响也很大。最终确定流速为1.0 ml·min-1 时，出峰时间和分离效果均较满意。

　　4 结论

　　本法操作简单，结果准确，重复性好，可作为该产品的质量控制方法。由于诃子提取物具有良好的药用价值，对多个系统疾病具有良好的治疗作用，具有较好的开发前景。本研究采用HPLC法测定诃子中鞣花酸含量，方法快速、简便、准确，测定结果可靠，为诃子在食品开发及医药应用上提供科学依据。

　　【参考文献】

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　　[2] 魏安池,周瑞宝,瞿水忠.诃子抗氧化性能的研究[J].郑州粮食学院学报,1998, 19(1):8.

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　　[9] 周本宏.高效液相色谱法测定石榴皮中鞣花酸含量[J].广东药学院学报,2005,2(1) ：693.

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