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蚕蛹(Bombyxmori L.)作为药用在我国有悠久的历史。现代研究表明，蚕蛹具有较高的营养价值，其中蚕蛹蛋白是一种优质蛋白质，不仅含有人体所需的8种必需氨基酸，且氨基酸配比均衡性好，国内已有厂家将蚕蛹水解制成复合氨基酸产品[1]。因此测定蚕蛹氨基酸组成，对以蚕蛹蛋白为原料进一步开发功能产品具有重要的参考价值。
目前，对氨基酸的测定除采用氨基酸自动分析仪外[2]，柱前衍生反相高效液相色谱法测定氨基酸的技术也得到了很大的发展，且具有快速灵敏、不需专用仪器等优点[3]。高效液相色谱法分析氨基酸时常用的柱前衍生试剂如OPA(邻苯二甲醛)、DANSYL_Cl(丹磺酰氯)、FMOC(9-芴甲基氯甲酸酯)和PITC(异硫氰酸苯酯)等各有优点和缺陷[4～6]。其中因为OPA 衍生步骤简单, 反应速度快, 剩余试剂不干扰测定, 衍生物可用紫外、荧光或电化学检测器检测，故其应用最广，但由于不能和仲氨酸反应，而FMOC 能与仲氨酸反应，因此将OPA-FMOC联用可克服两者单独使用时的缺点。本实验以OPA及FMOC为柱前衍生化试剂，利用二极管阵列(DAD)在同一通道用338 nm 和262 nm 双波长检测, 同时检测样品中的一级和二级氨基酸，建立了蚕蛹蛋白质氨基酸分析的方法。
1 仪器与试剂
Agilent1100高效液相色谱仪，配四元泵及真空在线脱气机，美国安捷伦科技有限公司产品;CSF-1型超声波清洗器，上海超声波仪器厂产品;101AS-2型电热恒温干燥箱，上海实验仪器有限公司产品。
18种氨基酸标准品、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)为进口分装产品;3-巯基丙酸(3-MPA)由Alfa Aesar公司，邻苯二甲醛，醋酸钠，三乙胺等为国产分析纯，上海国药试剂有限公司产品;甲醇，乙腈，四氢呋喃为色谱纯，天津四友色谱试剂厂产品。
2 方法
2.1 试剂配制流动相A：20 mmol/L 醋酸钠缓冲液(含0.5%四氢呋喃及0.3‰三乙胺，pH=10.3)，0.45 μm滤膜过滤，备用;流动相B：甲醇;流动相C：乙腈。衍生剂A(OPA试剂)：取270 mg OPA试剂，溶于2ml无水乙醇中，加入100 μl 3-巯基丙酸，0.2 mol/L硼酸缓冲液(pH 10.8)定容至50 ml，4℃避光保存。衍生剂B(FMOC试剂)：取10 mg FMOC试剂，乙腈定容至10ml。氨基酸标准溶液：18种氨基酸标准品各25 mg，0.1 mol/L HCl溶解定容至25 ml，摇匀，4℃保存。
2.2 水解 称取适量经一次脱脂的蚕蛹(约含蛋白质50 mg)于安瓿瓶中，加入6 mol/L HCl 5 ml ，抽真空封口，于110℃水解24 h，开口后在真空干燥器中去酸，定容至25ml，冷冻保存。因某些氨基酸如色氨酸、组氨酸等在酸性条件下容易被破坏[7]，需另取一定量的样品经6 mol/L NaOH于安瓿瓶中真空水解24 h，6 mol/L HCl中和，定容至25 ml，冷冻保存。
2.3 衍生分别取20 μl氨基酸标准液和样品水解液置于2ml的Eppendorf管中，加入70 μl的衍生剂A和10 μl的衍生剂B，振荡2 min后，经0.22 μm过滤膜过滤后进样。
2.4 色谱分析条件色谱柱为Agilent Eclipse AAA 氨基酸分析柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，DAD二极管阵列检测器， 1～32 min检测波长为338 nm，32 min后检测波长为262 nm，柱温为35℃，按在表1中的条件进行梯度洗脱。表1 流动相梯度洗脱程序
2.5 样品的定性与定量 样品的定性采用保留时间法，即在相同的色谱分析条件下，样品中氨基酸的色谱峰与氨基酸标准的色谱峰保留时间相同或者相近，则认为样品中含有此氨基酸。样品的定量采用标准曲线法，即配制一定浓度氨基酸混合溶液，得出各氨基酸与其峰面积之间的线性回归方程，在同样的色谱分析条件下，对样品中的氨基酸进行分析，根据峰面积与线性回归方程得出样品中氨基酸的浓度[8]。
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