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【关键词】 冰毒,麻黄碱,毛细管微乳液电动色谱,毛细管胶束电动色谱,分离
摘要 通过毛细管微乳液电动色谱10 min内同时分离了安非他明、甲基安非他明、4,5亚甲基二氧基安非他明(MDA)和3甲氧基4,5亚甲基二氧基安非他明(MDMA)4种苯丙胺类毒品及其麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱、甲基伪麻黄碱、去甲麻黄碱等麻黄生物碱杂质。比较了毛细管微乳液电动色谱和丁醇改进的胶束电动色谱模式对分离的影响，发现正丁醇是影响分离的最主要因素。本方法具有很好的重复性和稳定性，可实现对冰毒及其麻黄生物碱杂质的快速分析和鉴定，相对保留时间和相对峰面积的RSD分别小于1.3%和50%，可用于冰毒的实际来源推断。
关键词 冰毒，麻黄碱，毛细管微乳液电动色谱，毛细管胶束电动色谱，分离
1 引言
冰毒化学名为苯丙胺或安非他明，它能够刺激中枢神经系统大量释放多巴胺，使人达到精神兴奋，但长期服用后将使人体产生心律不齐、神经紊乱、精神紧张和幻觉等症状。目前非法合成冰毒类毒品主要是由麻黄碱和伪麻黄碱经氯化、氧化和降解而来，并且已经被进一步苯环上取代而发展为作用更强的一系列衍生物，这主要包括甲基安非他明、4,5亚甲基二氧基安非他明(MDA)和3甲氧基4,5亚甲基二氧基安非他明(MDMA)等[1]。到目前为止，冰毒是除海洛因外全球范围内最泛滥的毒品之一。对冰毒进行成分分析和来源推断是控制其制毒贩毒渠道的有效手段之一。而建立同时分离这些麻黄碱类杂质的分析方法对冰毒类毒品来源推断是至关重要的 [1，2]。
目前应用于毒品分离分析的技术主要有：色谱技术（薄层色谱、气相色谱（ＧＣ）、高效液相色谱（ＨＰＬＣ））、核磁共振（ＮＭＲ）技术以及毛细管电泳（ＣＥ）技术[1~3]。ＮＭＲ技术不适合复杂成分的分析，ＧＣ和ＨＰＬＣ则不适合对热不稳定和一些非极性物质的分离。相比而言，CE由于具有独特的分离机理和多种分离模式，可以适合对毒品中多组分样品进行分析。
在众多ＣＥ模式中，毛细管胶束电动色谱（ＭＥＫＣ）解决了毛细管区带电泳无法分离中性物质的问题，从而被认为最适合毒品复杂体系分析的毛细管模式[3]。Tagliaro等[4]首先使用MEKC模式实现了对包括苯丙胺和甲基苯丙胺２０种毒品的分离，但分离时间45 min，不适合实际样品的分离。只有Wallenborg[5]在ＣＥ芯片上通过MEKC模式，在3 min内分离了去甲麻黄碱、麻黄碱、伪麻黄碱、安非他明和甲基安非他明。但由于方法特殊性而无法普遍应用于实际冰毒分析。由于麻黄生物碱主要包括麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱、甲基伪麻黄碱、去甲麻黄碱和去甲伪麻黄碱６种，它们在麻黄植物中都有一定的含量，而且互为三对同分异构体，因此一般ＣＥ方法难以对其分离。到目前为止，还未见到ＭＥＫＣ同时分离上述冰毒类毒品和麻黄生物碱的报道。
近几年来，微乳液电动色谱(MEEKC)模式成为CE复杂样品分离研究的热点，由于将微乳液体系引入ＣＥ作为分离介质，这使得MEEKC模式分离范围更加广泛，选择性更好，分离速率更快，因此，MEEKC将特别适合对毒品复杂体系的分析 [6，7]。研究发现，MEEKC能够分离O6单乙酰吗啡和O3单乙酰吗啡同分异构体，具有很高的分离塔板数[8]。Zhang等[9]用MEEKCLIF在8min内实现了麻黄碱和假麻黄碱的分离，Zheng等[10]则通过使用手性共表面活性剂的ＭＥＫＣ对麻黄碱、甲基麻黄碱和去甲麻黄碱进行了手性分离。这些研究说明了MEEKC可用于以上所有冰毒类毒品和麻黄生物碱的同时分离。
MEEKC分离机理与MEKC模式相似，但对MEEKC来说，由于共表面活性剂介于油相和水相之间将表面张力减小至零，油滴体积小而且表面张力小，非分析物更容易穿过界面嵌入到胶束内部油滴中，被分析物可更加自由地在水相和油相间出入。这使得MEEKC分离速率更快 [11，12]。而目前MEKC中，通常需要添加甲醇和乙腈等有机溶剂来改进分离的选择性，由于这些溶剂存在胶束外的水相中，从而大大降低电渗流速度，使得分离时间非常长 [3]，不适合实际毒品的分析鉴定。最近有人[13，14]比较了用正丁醇改进的MEKC的分离情况，发现正丁醇MEKC在分离一些中性化合物时，具有和MEEKC类似的分离效率，但其对毒品这种复杂样品的分离情况还不得而知。
因此，本研究探讨MEEKC和正丁醇MEKC对苯丙胺类毒品及其麻黄生物碱的分离情况，选用安非他明、甲基安非他明、MDA、MDMA４种冰毒类毒品、以及麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱、甲基伪麻黄碱、去甲麻黄碱５种麻黄碱杂质为模型化合物，致力开发一种用于冰毒类毒品ＣＥ分析方法，从而为实际冰毒类毒品的鉴定提供强有力的分析工具。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Beckman MDQ毛细管电泳仪(美国贝克曼仪器公司)，二极管阵列检测器，检测波长200 nm，正向分离电压20 kV，25℃，检测窗口位于距阴极出口端10 cm处，40 cm×75 μm i.d. 石英毛细管柱（河北永年色谱配件厂）。
安非他明(1)、甲基安非他明(2)、MDA(3)、MDMA(4)标准品(公安部物证鉴定中心)，麻黄碱(5)、伪麻黄碱(6)、甲基麻黄碱(7)、甲基伪麻黄碱(8)、去甲麻黄碱(9)标准品(美国ChromaDex Inc. 公司); SDS纯度为98％(Sigma公司); 内标对甲苯胺(IS)和其它试剂均为分析纯(北京化学试剂公司)。实验用水为Millipore QS系统生产的超纯水。
2.2 实验方法
所有标准品及内标对甲苯胺(IS)溶液配制成甲醇溶液，然后用水稀释至相应的浓度。在所有缓冲溶液中，正辛烷、正丁醇、SDS、硼砂溶液按质量比配制，缓冲溶液总质量保持50g，混合后密闭超声30min。使用水配制硼砂缓冲液，用1 mol/L NaOH和H3PO4溶液调节缓冲溶液的pH值。缓冲溶液、样品溶液和冲洗毛细管柱的水、NaOH溶液使用前都经过滤，并超声3 min脱气。
新的毛细管使用前用1.0 mol/L NaOH溶液活化30 min，水冲洗20 min，缓冲溶液润洗3 min。进样间0.1 mol/L NaOH溶液、水分别冲洗2 min，再用缓冲溶液冲洗2 min。每天实验完毕先后用水、0.1 mol/L NaOH溶液、水分别冲洗5、10、10 min。
电泳测试步骤：用NaOH溶液、水、缓冲溶液分别冲洗2 min。然后正向压力0.5 psi进样5 s，在分离电压20 kV、25℃下分离10 min。
3 结果与讨论
3.1 冰毒的MEEKC法分离
冰毒类毒品和麻黄生物碱结构相近，都属于苯胺类化合物，属于弱碱性。对于结构相近的分析物来说，在众多分离影响因素中，油相种类及浓度变化基本不对分离产生影响，SDS浓度和水相电解质浓度主要对MEEKC分离时间有影响，而调节分离度的能力较弱，影响分离效率最主要因素为pH值和共表面活性剂比例。
3.1.1 pH对MEEKC分离的影响 pH对4种冰毒类毒品和5种麻黄类生物碱MEEKC分离的影响如图1所示。从图１可以看到，所有9种被测试物质和内标ＩＳ能够在10 min之内出峰，4种冰毒类毒品达到基线分离，而且几对麻黄生物碱同分异构体都得到了很好的分离，这证明了MEEKC能快速分离所有冰毒类毒品和麻黄碱杂质。
图1 不同pH对冰毒类毒品微乳液电动色谱模式分离的影响（略）
Fig．1 Influence of different pH on microemulsion electrokinetic chromatogrpahic (MEEKC) separation
缓冲液体系(buffer system): 十二烷基磺酸纳(sodium clodecyl sulfonate, SDS) 3.31%, 正辛烷(noctane) 0.90%, 正丁醇(1butanol) 6.72%, 5 mmol/L 硼砂水溶液(sodium borate solution) 89.07%。峰(peak): 1. 安非他明(amphetamine), 2. 甲基安非他明(methylamphetamine), 3. 4,5亚甲基二氧基安非他明(3,4methylenedioxyamphetamine, MDA), 4. 3甲氧基4,5亚甲基二氧基安非他明(3,4methylanedioxymethylamphetamine, MDMA), 5. 麻黄碱(ephedrine), 6. 伪麻黄碱(pseudoephedrine), 7. 甲基麻黄碱(methylephedrine), 8. 甲基伪麻黄碱(methylpseudoephedrine), 9. 去甲麻黄碱(norephedrine), IS对甲苯胺(ptoluidine)。
从出峰情况来看，5种麻黄生物碱出峰位置在4种冰毒类毒品之前，这是因为麻黄生物碱丙基上多一个羟基，因而负电性较冰毒毒品高，带微乳液SDS阴离子基团之间的排斥力更大，导致在微乳液内相中分配能力较弱，受到电渗流的推动而出峰在前。另外，9种物质的出峰次序基本不随pH值改变而改变，表明这9种同类碱性物质碱性差别小，这是因为在考察的pH值范围内，9种胺类物质质子化受到抑制，正电荷减少而趋向中性，迁移行为主要由物质在两相中的分配状况和质量数决定，在不同pH值条件下迁移行为相对稳定。但可以看到，pH的提高是有助于提高5种麻黄生物碱杂质的相对分离度，但彼此之间的分离度降低。如麻黄碱(5)和伪麻黄碱(6)之间、甲基麻黄碱(7)和甲基伪麻黄碱(8)之间相互靠拢，这也从另一方面说明，pH值的提高将减小这些生物碱的带正电差异，即质子化程度降低而趋近中性。可以预见，当在强碱性时，这些同分异构体将减少差异，从而无法得到分离。pH的提高也有助于4种冰毒类毒品的分离度。由于MDA和甲基苯丙胺在低pH下有重叠，当pH提高时，苯丙胺和MDA伯胺相互接近，而甲基苯丙胺和MDMA一级胺相互接近，从而使MDA和甲基苯丙胺的分离度提高。因此，上述结果表明，pH提高将降低同类胺之间的带电差异，而使同类胺之间的分离效率降低。根据本分离体系的情况，pH为9.5时具有较好的分离效果。
3.1.2 正丁醇对MEEKC分离的影响 图2是不同正丁醇比例下，9种胺类的分离情况。从图2可以看出，9种分析物在低正丁醇比例时分离情况更好。随着正丁醇浓度的增加，分离效率降低，而使所有物质无法达到基线分离。在正丁醇比例为6.02%时，9种冰毒类毒品和麻黄生物碱都得到了基线分离，说明正丁醇浓度低时有更高的分离塔板数。这是因为正丁醇主要存在于微乳液的双亲界面层，使微乳液滴体积增大，表面电荷密度变小，微乳液刚性减小，将表面张力减小至零，油滴体积小而且表面张力小，溶质受到的微乳液SDS静电作用减小，将能更加自由地进出微乳液，因而微乳液内部油相的作用随着正丁醇浓度的增加而降低。另外，由于共表面活性剂主要存在于微乳液内部和双亲层里，对电渗流的影响较小。但分析物在微乳液内外交换速度大大增加，使整体分离窗口被挤压，分离时间逐渐缩短，各溶质出峰时间互相拥挤，从而也使整个分离情况变差。此外，9种胺类分析物出峰顺序不受正丁醇比例的影响，这表明9种分析物的分离是主要建立在物质在两相中的分配系数的差异上，而这时由于pH稳定，各分析物的荷质比保持相对稳定，从而对出峰顺序不产生影响。
图2 不同正丁醇比例对冰毒类毒品微乳液电动色谱模式分离的影响（略）
Fig．2 Influence of 1butanol on MEEKC separation
缓冲液体系(buffer system): 十二烷基磺酸纳(SDS) 3.31%; 正辛烷(noctane) 0.90%; 5 mmol/L硼砂水溶液＋正丁醇(1butanol and sodium borate solution) 95.79%, pH 9.5。其它条件同图1(other conditions were same as those in Fig.1).
3.2 冰毒的正丁醇MEKC法分离
3.2.1 pH对MEKC分离的影响 pH对4种冰毒类毒品和5种麻黄类生物碱正丁醇MEKC分离的影响如图3所示。从图3可以看出，9种被测试物质和内标对甲苯胺也能够在10 min之内出峰，但较MEEKC情况要差一些。从出峰情况来看，基本与MEEKC模式分离相近。由于麻黄生物碱丙基上多个羟基，5种麻黄生物碱出峰位置在4种冰毒类毒品之前。另外，9种物质的出峰次序基本不随pH值改变而改变，这也表明这9种同类碱性物质碱性差别小，这是因为在考察的pH值范围内，9种胺类物质质子化受到抑制，正电荷减少而趋向中性，迁移行为主要由物质在胶束和水相两相中的分配状况和质量数决定。但可以看到，9种分析物的正丁醇MEKC模式出峰时间要比MEEKC模式下分离速度快，这是由于胶束内部没有油相，分析物在胶束内的停留时间缩短，因而出峰时间快。因此，如图３MEEKC模式，pH提高也有利于分离。根据本分离体系，pH为9.5时具有较好的整体分离效果，9种胺类化合物也都得到了基线分离。
3.2.2 正丁醇对MEKC分离的影响 图4是不同正丁醇比例下，9种胺类的分离情况。如图4所示，MEKC模式下使用正丁醇作为有机添加剂时，9种被测试的分析物也能够在10 min完成分离。但正丁醇MEKC对9种物质的分离效率较MEEKC模式差，各种溶质之间的分离度较差。但随着正丁醇浓度的增加，分离效率有所提高，尤其对苯丙胺和MDA这对伯胺、以及甲基苯丙胺和MDMA一级胺的分离度明显改善，原因可能为正丁醇可以进入胶束内部充当油相的作用，从而使得被分析物在胶束和缓冲液分配差异增大。
图3 不同pH对冰毒类毒品正丁醇胶束电动模式分离的影响（略）
Fig．3 Influence of different pH on 1butanol modified micellar electrokinetic chromatographic (MEKC) separation
缓冲液体系(buffer system): 十二烷基磺酸纳(SDS) 3.31%; 正丁醇(1butanol) 6.72%; 5 mmol/L 硼砂水溶液(sodium borate solution) 89.97%.其它条件同图1(other conditions were same as those in Fig.1)。
图4 不同正丁醇比例对冰毒类毒品正丁醇胶束电动色谱模式分离的影响（略）
Fig．4 Influence of 1butanol on 1butanol modified MEKC separation
缓冲液体系(buffer system): 十二烷基磺酸钠(SDS) 3.31%; 5 mmol/L硼砂水溶液 ＋正丁醇(1butanol and 5 mmol/L sodium borate solution) 96.69%; pH 9.5。其它条件同图1(other conditions were same as those in Fig.1).
图5 最佳微乳液电动色谱分离谱图（略）
Fig．5 Typical MEEKC separation of drug test mixture
缓冲液体系(buffer system): 十二烷基磺酸钠(SDS) 3.31%; 正辛烷(noctane) 0.90%; 正丁醇(1butanol) 6.02%; 5 mmol/L 硼砂水溶液(sodium borate solution) 89.77%; pH 9.5.其它条件同图1(other conditions were same as those in Fig.1).
但在高正丁醇比例时，由于正丁醇进入胶束内部而使胶束结构变得非常松散，因而分析物能够更加快速地进出胶束，使分析窗口大大压缩，反而使得整个分离度变差。结果表明，MEEKC模式中胶束内油相的存在对提高胶束粒子的分离效率非常关键，使得MEEKC具有比相类似的正丁醇MEKC具有更高的分离效率。但在正丁醇高浓度下，这两种模式的分离情况相似，也说明由于正丁醇进入胶束内部，使得MEEKC中油相的作用被掩盖。总之，在pH为9.5、正丁醇为6.72%时，正丁醇MEKC对9种被测试冰毒毒品及其麻黄碱杂质分离情况最好，基本达到了基线分离。
3.3 冰毒和麻黄生物碱最佳MEEKC分离条件
综上所述，9种冰毒类毒品和麻黄生物碱的最佳分离模式为MEEKC，其分离条件为：SDS 3.31%，正辛烷0.90%，正丁醇6.02%，5mmol/L硼砂水溶液89.77%，pH 9.5。在最佳条件下，9种模型化合物分离谱图如图5所示。由图５可见，9种冰毒类毒品及相关化合物基本都得到了基线分离。
在MEEKC最佳分离条件下，对9种毒品和内标对甲苯胺的混合溶液重复进样5次，计算相对迁移时间和相对峰面积的RSD。结果见表1。由表1可知，各峰的相对保留时间的RSD均＜1.3%；相对峰面积的RSD均＜5%，表明方法的重复性良好，该方法有很好的稳定性。
表1 微乳液电动色谱方法分离9种冰毒类毒品成分的重复性实验结果（略）
Table 1 Repeatability test results of MEEKC separation for 9 test drugs
4 结论
选择4种主要冰毒类毒品和可能出现的5种麻黄类生物碱，实现了9种冰毒类MEEKC模式的快速分离。分离在10 min内完成，其中几对麻黄生物碱同分异构体亦得到了很好的分离。以对甲苯胺为内标，方法重复性和稳定性良好，可应用于冰毒类毒品的快速鉴定、成分定性定量分析。
还研究了MEEKC和正丁醇MEKC2种模式对其分离的影响，发现正丁醇MEKC模式亦可以实现9种冰毒类的分离，其中几对麻黄生物碱同分异构体亦得到了很好的分离。和MEEKC分离的对比研究，揭示了微乳液中油相的存在是MEEKC具有更高分离效率的关键控制因素，同时亦进一步证明了共表面活性剂比例的增加将使共表面活性剂改进的MEKC的分离效率趋势同于MEEKC。此外，还发现pH是调节这两种模式总体分离度的有效控制因素。
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本文系国家科技部十五攻关（No.2001DA801B04）和国家863（No.2002AA2Z2004）基金资助项目
（清华大学化学系，北京 100084）
（北京市公安局法医检验检测中心，北京 100085）
（公安部科技局，北京 100741）
（公安部物证鉴定中心，北京100038）