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【摘要】 目的 建立狼疮灵颗粒中芍药苷的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法,色谱柱：Hypersil ODS-2 (150 mm×4.6 mm,5.0 μm)；流动相：乙腈-0.4%的磷酸水溶液(10∶90)；检测波长：230 nm；流速：1.0 mL/min,柱温：25 ℃。结果 芍药苷在0.608～3.04 μg范围内呈良好的线性关系(r＝0.999 9),加样回收率97.77%,RSD＝0.62% (n＝5)。结论 该方法快速可行、简捷准确、重复性好、结果可靠,可用于控制狼疮灵颗粒的质量。
【关键词】 狼疮灵颗粒；芍药苷；高效液相色谱法；含量测定
Abstract：Objective To establish an accurate method for determination of paeoniflorin in Langchuagnling Granules. Methods Hypersil ODS-2 (4.6 mm×150 mm, 5.0 μm) in an oven at 25 ℃ was need, with a mobile phase consisting of acetonitril-0.4% granolite treatment (10∶90) and UV detector at 230 nm, the flow rate was 1.0 mL/min. Result The linear range of paeoniflorin was within 0.608～3.04 μg (r＝0.999 9). The average recovery was 97.77% and RSD was 0.62% (n＝5). Conclusion The method is simple and accurate. It can be used for the quality control of Langchuagnling Granules.
Key words：Langchuangling Granules；paeoniflorin；HPLC；content determination
狼疮灵颗粒主要是由赤芍、牡丹皮、生地黄、忍冬藤等中药组成的医院复方制剂,具有凉血散瘀、清热解毒之功效。方中芍药苷为主要有效成分,具有浓度和机能依赖性的双向免疫调节作用,临床主要用于治疗系统性红斑狼疮。本研究采用高效液相色谱(HPLC)法对狼疮灵颗粒中芍药苷进行含量测定,建立芍药苷含量的HPLC测定方法[1-2]。
1 仪器与试药
Agilent 1100 型高效液相色谱仪,Mettler Toledo AG135型电子分析天平(瑞士Mettler公司),SCQ-250型超声波提取仪(上海申波超声公司)。芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所提供,批号110736-200732)；狼疮灵颗粒(成都中医药大学附属医院提供,批号100315、100318、100322、100329,规格为15 g/袋)。乙腈为色谱纯,水为纯净水,其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Hypersil ODS-2(4.6 mm×150 mm,5.0 μm,依利特公司)；流动相：乙腈-0.4%的磷酸水溶液(10∶90)；检测波长：230 nm；流速1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。
2.2 溶液制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品3.04 mg,置10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,即得对照品溶液(1 mL含芍药苷0.304 mg)。
2.2.2 供试品溶液的制备 取本品0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 mL,摇匀,称定重量,超声处理(功率300 W,频率40 kHz)20 min,放冷至室温[3],再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.2.3 阴性对照品溶液的制备 按狼疮灵颗粒制备工艺制得缺少赤芍的阴性样品制剂,再按“2.2.2”项下方法制得阴性对照品溶液。
2.3 线性关系考察
取上述对照品溶液,分别自动进样2、4、6、8、10 μL。以芍药苷峰面积积分值为纵坐标,以芍药苷对照品的进样量(μg)为横坐标,绘制标准曲线。得回归方程为：Y＝1 427.68X＋5.96, r＝0.999 9。结果表明,进样量在0.608～3.04 μg范围内线性关系良好。
2.4 专属性试验
精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10 μL,按上述色谱条件测定。结果在芍药苷出峰位置无干扰峰。
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液10 μL,重复进样5次,测得峰面积积分值,计算,得芍药苷的RSD＝1.19%(n＝5),表明精密度良好。
2.6 稳定性试验
精密吸取同一批号的供试品溶液(批号100318),按色谱条件分别于制备后0、4、8、12、16、24 h进行测定。记录峰面积,计算得芍药苷的RSD＝1.30%(n＝5),表明芍药苷含量在24 h内稳定性好。
2.7 重复性试验
精密称取同一批号(批号100318)的样品5份,按供试品溶液制备方法制备,并按上述色谱条件测定,测得芍药苷平均含量9.73 mg/g,RSD＝1.24%(n＝5)。
2.8 加样回收率试验
精密称取已知含量的狼疮灵颗粒0.10 g,精密添加一定量的芍药苷对照品,按供试品溶液制备方法制备,并按上述色谱条件测定。结果平均回收率为97.77%,RSD＝0.62%。见表1。
2.9 样品测定
分别精密称取不同批号的狼疮灵颗粒约0.5 g,按供试品溶液制备方法制备,按以上色谱条件测试。结果见表2。根据试验结果,考虑到药材的来源,以及制剂生产、储藏等因素,暂拟定每批样品以芍药苷含量为标准,每1 g颗粒不得低于9.7 mg。
表1 加样回收率试验结果
样品重
量(g) 样品中含
量(mg) 加入量
(mg) 测得量
(mg) 回收率
(%) 平均回收
率(%) RSD
(%)
0.101 9 0.991 1.001 1.967 97.43
0.102 4 0.996 0.975 1.955 98.35
0.101 7 0.989 0.987 1.946 96.92 97.77 0.62
0.101 5 0.987 0.990 1.961 98.29
0.102 3 0.995 0.984 1.958 97.84
表2 样品中芍药苷含量测定结果(mg/g)
批号 芍药苷含量 平均含量
1 2 3
100315 9.78 9.71 9.73 9.74
100322 9.74 9.70 9.71 9.72
100329 9.72 9.78 9.78 9.76
3 讨论
本试验考察了水浴回流提取、超声提取、索氏提取3种方法,结果超声提取法优于回流法和索氏提取法；考察了甲醇、70%乙醇和50%乙醇等3种提取溶媒对芍药苷提取效果的影响,结果甲醇提取效果明显优于70%乙醇和50%乙醇；考察了提取时间对芍药苷提取效果的影响,结果以甲醇为提取溶媒,超声提取20 min效果较优。
本试验曾采用2005年版《中华人民共和国药典》(一部)赤芍中芍药苷测定所用流动相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(40∶65),结果主峰分离度不好,存在干扰,经过分析比较,确定了乙腈-0.4%磷酸水溶液(10∶90)为流动相,杂峰集中,可使芍药苷得到较好的分离。
本法提取方法简单,分析快速,精密度高,重复性好,阴性无干扰,可较好控制本品的质量。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：化学工业出版社,2005：68.
[2] 李越峰,杨武亮,沈菲,等.高效液相色谱测定白芍中芍药苷的含量[J].时珍国医国药,2008,19(2)：438－439.
[3] 蒋玉珍,顾海成.高效液相色谱法测定根痛平滴丸中葛根素及芍药苷的含量[J].南京中医药大学学报,2008,28(23)：2070－2073.