高效液相色谱法测定郁李仁中苦杏仁苷的含量

　　【摘要】 目的 建立高效液相色谱法测定郁李仁中苦杏仁苷含量的方法。方法 色谱柱：Supelco ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：甲醇-水(20∶80)；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm。结果 苦杏仁苷峰分离良好,苦杏仁苷浓度在0.066 13～4.232 μg间线性关系良好,r＝1.000 0,平均回收率为95.91%(RSD＝2.29%)。结论 本方法准确、可靠,可用于郁李仁中苦杏仁苷的含量测定。

　　【关键词】  郁李仁；苦杏仁苷；高效液相色谱法；含量测定

　　Abstract：Objective To establish a HPLC method for the determination of amygdalin in Semen Pruni. Methods The analytical column was Supelco ODS C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm), with methanol-water (20∶80) as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL/min, and the detection wavelength was 210 nm. Results The linear range for amygdalin was 0.066 13～4.232 μg (r＝1.000 0). The average recovery was 95.91% (RSD＝2.29%). Conclusion The method is accurate and reliable, and can be used in the determination of amygdalin in Semen Pruni.

　　Key words：Semen Pruni；amygdalin；HPLC；content determination

　　郁李仁为蔷薇科植物欧李Prunus humilis Bge.、郁李 Prunus japonica Thunb.或长柄扁桃Prunus pedunculata Maxim.的干燥成熟种子,前二者习称“小李仁”,后者习称“大李仁”,具有润燥滑肠、下气、利水的功效[1]。苦杏仁苷为郁李仁的主要成分之一,2005年版《中华人民共和国药典》在该药材含量测定项下采用银量法测定,但银量法属于间接测定方法,影响因素多,而目前采用其他方法对郁李仁进行含量测定的报道较少。笔者采用高效液相色谱(HPLC)法直接测定郁李仁中苦杏仁苷的含量,方法准确、可靠,为郁李仁中苦杏仁苷的含量测定提供了依据和参考。

　　1  仪器与试药

　　1.1  仪器

　　Waters 515泵高效液相色谱仪,Waters 2487紫外检测器,ZW色谱柱,恒温箱(中国科学院大连化物所),Empower色谱工作站,Agilent手动进样器(20 μL)；十万分之一电子分析天平(BP- 211D型,德国Sartorius)；Cary50紫外分光光度计(美国瓦里安)。

　　1.2  试药

　　苦杏仁苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号110820- 200403)；郁李仁药材购自安徽亳州药材市场,经鉴定分别为蔷薇科植物郁李和长柄扁桃的干燥成熟种子。乙腈为色谱纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件

　　色谱柱：Supelco ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：甲醇-水(20∶80)；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm,进样量：20 μL。色谱图见图1。

　　2.2  对照品溶液的制备

　　精密称取经五氧化二磷减压干燥12 h的苦杏仁苷对照品42.32 mg,置10 mL量瓶中,用70%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得苦杏仁苷4.232 mg/mL的对照品溶液。

　　2.3  供试品溶液的制备

　　取郁李仁粗粉0.3 g,精密称定,置具塞三角烧瓶中,加石油醚(60～90 ℃)50 mL,回流提取1 h,过滤,以石油醚分3次洗涤滤渣及容器,每次10 mL,弃去石油醚液,滤纸及滤渣挥干溶剂,置原容器中,精密加入70%甲醇溶液50 mL,精密称定,回流提取1 h,放冷至室温,再称重,用70%甲醇补足失重,抽滤,精密量取续滤液5 mL置10 mL量瓶中,以70%甲醇稀释至刻度,以0.45 μm滤膜滤过,取续滤液即得。

　　2.4  线性关系考察

　　精密量取苦杏仁苷对照品溶液1 mL置10 mL量瓶中,用70%甲醇稀释至刻度,再依次稀释,制得含苦杏仁苷211.6、105.8、52.9、26.45、13.225、6.612 5、3.306 25 μg/mL的对照品溶液。分别精密吸取各20 μL进样测定,以峰面积积分值对浓度进行回归分析,得苦杏仁苷回归方程为：Y＝22 645X＋10 860,r＝1.000 0；苦杏仁苷线性范围为0.066 13～4.232 μg。

　　2.5  精密度试验

　　精密吸取同一供试品溶液重复进样6次,测得苦杏仁苷峰面积积分值的RSD＝0.86%。

　　2.6  重复性试验

　　取同一批次样品6份,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按照“2.1”项下色谱条件测定,结果苦杏仁苷的平均含量为3.16%,RSD＝1.35%。

　　2.7  稳定性试验

　　取同一供试品溶液于配制后0、2、4、6、8、10、24 h测定,计算峰面积RSD＝1.11%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

　　2.8  加样回收率试验

　　精密称取已知含量的同一批次(批号080121)郁李仁粉末6份,每份约0.15 g,脱脂后分别精密加入4.232 mg/mL的苦杏仁苷对照品溶液1 mL,依法制备供试品溶液并测定。结果见表1。表1  加样回收率试验结果（略）

　　2.9  样品含量测定

　　分别测定了小李仁、大李仁药材各3批,采用外标法计算苦杏仁苷的含量,结果符合要求。表2  样品中苦杏仁苷含量测定结果(略)

　　3  讨论

　　本研究试验了多种流动相比例和流速[2-6],采用甲醇-水(20∶80)作为流动相,苦杏仁苷峰能较好分离,且出峰时间适当；水相中加入缓冲盐或酸对测定结果无明显影响,故水相选择纯水；色谱柱柱温设定25、35、40 ℃对分析结果无明显影响,故柱温设为25 ℃。

　　由于郁李仁中含有大量的油脂,如不除去测定时易引起干扰,且连续测定含油脂样品还可能引起色谱柱柱效降低,故提取前应先脱脂；文献报道[7]和本次试验结果均表明石油醚脱脂效果优于乙醚,故选择石油醚作为脱脂溶剂。苦杏仁苷易被苦杏仁苷酶水解,故一般测定时采用甲醇为提取溶剂,但甲醇提取液直接进行测定时,苦杏仁苷峰前拖尾现象严重,改用70%甲醇为提取溶剂时,峰形有很大改善,理论塔板数增加近1倍。比较了不同时间回流和超声提取效果,结果回流1 h可将苦杏仁苷提取完全,效果优于超声提取。

　　2005年版《中华人民共和国药典》在郁李仁含量测定项下采用的是银量法,其原理是用硝酸银滴定苦杏仁苷水解产生的氢氰酸来计算含量,苦杏仁苷的水解程度对结果影响较大,且在判断滴定终点时不同操作人员之间存在较大误差；采用HPLC法可直接测定药材中苦杏仁苷含量,结果客观准确,方法可靠。

　　【参考文献】
　　[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.144.

　　[2] 王友兰,李红兵,华玉琴.HPLC法测定桃仁中苦杏仁苷的含量[J].中国药师,2002,5(9)：550,556.

　　[3] 甄 攀,王德宝,贾天军,等.郁李仁中苦杏仁甙的HPLC分析[J].张家口医学院学报,2002,19(5)：13－14.

　　[4] 袁 丹,胡 爽,毕开顺,等.桃仁药材质量评价法的研究[J].中国药学杂志,2003,38(1)：53－56.

　　[5] 吴 迪,王建中,赵云霞,等.苦杏仁苷几种测定方法的比较研究[J].食品工业科技,2006,27(2)：184－185,189.

　　[6] 王乾蕾,李运景,余 健,等.高效液相色谱法测定清肺合剂中苦杏仁苷含量[J].中国药业,2008,17(19)：31－32.

　　[7] 闾肖波,苏宝根,杨亦文.纯苦杏仁苷的制备[J].中国医药工业杂志, 2006,37(3)：165－167.