牛凝血酶的制备和纯化

　1.牛血浆的预处理　新鲜牛血浆于 - 20℃冷冻1周以上,自然解冻,绸布过滤去除絮状物,得滤液,备用。试验前另取等量新鲜血浆,备用。 　2.凝血酶原的制备　取冷冻血浆12 000 mL。分成 3 份,分别加入血浆体积 8%,12%和 16%的1 mol/L BaCl2溶液,均搅拌20min,压滤,取滤饼分别用pH7.4,0.02mol/L Tris2HCl(含0.15mol/LBaCl2,0.1 mol/L NaCl)缓冲液洗涤2次,再分别用pH7.4,0.02 mol/L Tris2HCl(含0.2 mol/L EDTA,0.1 mol/LNaCl)400 mL解吸附,3 000 r/min离心20 min,取上清;向上清液中加入固体硫酸铵至 35%饱和度,静置2 h后3 000 r/min离心20 min,上清液中再加入固体硫酸铵至65%饱和度,静置4 h,3 000 r/min离心20 min,沉淀用生理盐水(10 mg/mL)溶解后流水透析过夜。用碱性碘化汞钾试液检测透析内液,待铵离子为阴性后终止透析,收集得凝血酶原溶液。 　3.凝血酶原的激活条件试验 3.1　Ca2+浓度对凝血酶活力的影响　取12%BaCl2组凝血酶原溶液适量,分成数份,加入 CaCl2至不同终浓度,于37℃激活1 h,测定凝血酶活性。　Ca2+激活时间对凝血酶活力的影响　取12%BaCl2组凝血酶原溶液适量,加入CaCl2溶液使其终浓度达到2.4.3.1项中凝血酶活性最高组所用的CaCl2终浓度, 37℃水浴,于不同时间取样测定凝血酶活性。 3.2 　含Ca2+的兔脑粉浸液对凝血酶原的激活效果　取12%BaCl2组凝血酶原溶液适量,加入Ca2Cl2溶液使其终浓度为0.05 mol/L,再加入凝血酶原溶液1/10体积的兔脑粉(40 mg/mL)生理盐水浸液,37℃水浴1 h,测定凝血酶活性。 　4.凝血酶粗酶液的制备 　按最佳激活条件(Ca2+0.05 mol/L,37℃,30 min) ,分别将2项制备的溶液激活,用相对分子质量截留量10 000的超滤器超滤。待超滤液中加入0.1 mol/L AgNO3溶液不出现絮状沉淀时停止超滤,收集浓缩液,测定蛋白质浓度、酶活性,计算产量。 5　血浆冷冻对凝血酶活性的影响　取新鲜血浆和- 20℃下冷冻1周的血浆各4 000 mL ,滤过后分别按血浆体积的 12%加入 1 mol/L BaCl2,再按2项方法制备凝血酶原溶液,按4项方法制备凝血酶粗酶液。 6　凝血酶分离与纯化　将5项由冷冻血浆制备的凝血酶粗酶液上样到用pH5.5,0.01 mol/L醋酸铵缓冲液平衡好的CM2Sepharose Fast Flow离子交换柱,用同样缓冲液洗脱2～3个柱体积后,用含0～0.6 mol/L NaCl 的上述缓冲液进行直线梯度洗脱,流速6 mL/ (管·min) ,收集凝血活性组份即为凝血酶精品,测定蛋白质含量和活性。