丹参药材乙醇提取物高效液相色谱指纹图谱研究中药指纹图谱 | 39康复网

摘要:目的建立丹参药材乙醉提取物高效液相色谱指纹图谱，以便比较完整地反映丹参内在化学信息，全面评价丹参内在质量，初步揭示指纹图谱与药物作用的关系。方法采用梯度洗脱高效液相色谱法分析丹参乙醉提取物。结果建立了丹参指纹图谱，以隐丹参酮为参照物，得出主要共有峰相对保留时间、相对峰面积，作为丹参指纹图语相关技术参数。对4个产地的丹参样品侧定显示主要共有峰相对保留时间重复性好(RSD< 1 .0% )、相对峰面积有明显差别。结论丹参药材指纹图语可用于评价丹参药材质量，同时通过对指纹图语解析，可对药材进行治疗作用强弱或治疗作用取向的评价。
关键词:高效液相色谱法;指纹图谱;丹参药材乙醉提取物
    丹参是唇形科鼠尾草属植物丹参(Salviam dtiorrhizaB ge)的干燥根及根茎，为中医临床常用中药。20世纪30年代以来，国内外对丹参的化学、药理、药效、临床应用进行了较全面研究，对丹参中某些活性化合物定性、定量方法也有较多研究报道。本实验以丹参活性成分隐丹参酮为参照物，研究建立了丹参乙醇提取物高效液相色谱指纹图谱，以便比较完整地反映丹参内在化学信息，全面评价丹参内在质量。同时在对指纹图谱部分主要特征峰分析基础上，初步揭示指纹图谱与药物作用的关系。
    1 材料
    实验用药材2001年9月采自北京希力药业(集团)公司丹参原料种植基地(山东移植200109)、山东临沂(野生200109)、河北青龙(青龙200109)和河北遵化(遵化200109)按照中国药典2000年版(一部)规定的中药材取样方法，山东移植丹参取样10批次，其他丹参取样1批次。二氢丹参酮I对照品(0868-9701),隐丹参酮对照品(0852-9902)、丹参酮I对照品(0867-9701)和丹参酮IA对照品(0766-200010)(中国药品生物制品检定所)。
    2 溶液制备
    2.1 供试品溶液制备
    将丹参粉碎成粗粉，取2g，精密称定，置100ML磨口锥型瓶中，精密加乙醇50 ml,，精密称定，水浴加热回流60min，擦净瓶壁，放冷至室温，精密称量，补充溶剂，摇匀，即得。
    2.2 对照品溶液制备
    二氢丹参酮工对照品储备液为94.0μg/m L乙醇溶液，隐丹参酮对照品储备液为280.0 μg/m L乙醇溶液，丹参酮I对照品储备液为124.0μg/m L乙醇溶液，丹参酮IA对照品储备液为96.0μg/m L乙醇溶液。
    分别精密量取二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I对照品储备液各10 mL和丹参酮IA对照品储备液20 ml,，置同一50 ml,棕色量瓶中，摇匀，制成对照品混合溶液。精密量取对照品混合溶液7 ml,，置25 mL棕色量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1 ML分别含二氢丹参酮15.264 μg，隐丹参酮15.68μg，丹参酮16.944μg和丹参酮IIA 1 0.75μg).
    3 仪器、试剂和测定方法
    3.1 仪器与试剂
    BIO-RAD 公司2800液相色谱泵，7215型手动进样器(USA),BIO-DIMENSION三维紫外可见分光光度检测器，TL9900色谱数据工作站。
    乙睛 (天津市西华特种试剂厂，20010818)色谱纯，无水乙醇(北京益利精细化学品有限公司，20010907)，水为纯化水。
    3.2 测定方法
    采用高效液相色谱法。Kromasil100 C18分析色谱柱(4.6nunx 250m m,5μm),C18保护柱(4.6m mx 5 m m,5 μm)(北京分析仪器厂)。流动相分为A,B 两种:A为乙睛,B为10%乙睛。梯度洗脱程序:自0.00一80 min，流动相A由40%-60%，流动相B由60%一40%;自80一90 min，流动相A为60%，流动相B为40%;流速1.0m L/mi n，检测波长254nm,记录时间90 min.
    3.3 精密度
    取同一供试品溶液，连续进样5次，以隐丹参酮(S峰)为参照物，考察主要共有峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果表明，仪器精密度符合规定(RSD均不大于3%).
    3.4 稳定性
    取同一批丹参样品溶液，72h内进样检测5次，以隐丹参酮(S峰)为参照物，考察主要共有峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果表明，溶液在72 h内稳定(RSD)均不大于3%.
    3.5 重现性
    取同一批丹参样品5份，分别按“2.1”项下方法，重复制备样品后检测。以隐丹参酮(S峰)为参照物，考察主要共有峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果表明，实验方法重现性符合要求(RSD均不大于3%.
    4 指纹图谱建立及各项技术参数
    根据10批次丹参样品色谱分析结果，丹参药材可分离出10余个成分，从中选取8个可以作为构成指纹图谱的主要共有峰(稳定的特征峰)。经与4种对照品色谱图比较，确认2,4,5和7号峰分别是二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮nA。根据8个主要共有峰的保留时间和积分面积，以隐丹参酮对照品(S峰)为参照物，求得主要共有峰相对保留时间、相对峰面积，作为丹参指纹图谱相关技术参数。
    5 样品测定
    对4个产地不同批次的丹参样品，分别按“2.1”项下方法，取样测定，以隐丹参酮(S峰)为参照物计算，主要共有峰相对保留时间重复性好(RSD< 1.0%)、相对峰面积有明显差别，结果见图2和表20
    6讨论
    6.1 丹参中化学成分按溶解性可分为水溶性与脂溶性两大类。水溶性成分多为丹酚酸类化合物，具有抗血栓、改善血液循环、抗氧化损伤等作用;脂溶性成分主要为二菇酿类化合物(丹参酮类和罗列酮类)，具有抗菌、消炎和类雌激素等作用。丹参酮中隐丹参酮、二氢丹参酮I和丹参酸甲醋等有抗金黄色葡萄球菌作用。
    6.2 从丹参8个特征峰构成的指纹图谱全貌来看，尽管不同产地样品之间各峰的表观丰度有差异，但主要共有峰相对保留时间具有良好的一致性，整体面貌极其相似。因此，可以用丹参指纹图谱鉴别丹参并较全面地评价其质量。丹参的指纹图谱主要共存峰相对保留时间，取决于化合物特定的色谱行为，因此一致性好;相对积分面积取决于特定批次样品的相对含量，所以有显著差别。就天然药物而言，相对积分面积存在差异或显著差异是很自然的，几无差异或差异较小，要具备严格的地域、种殖、种子复壮、采收、加工炮制等条件。
    6.3 测定方法采用高效液相色谱梯度洗脱，可以较好地分离8个稳定特征峰，保证相关参数稳定。
    6.4 丹参药材HPLC在线三维光谱扫描结果显示，在254 nm出峰多且主要共有峰吸收强度较大，能提供较好的色谱指纹信息，因此，选择254 nm作为测定波长。
    6.5 乙睛与水即使分别脱气处理，混合后也会产生较多气泡，导致噪音增加，精密度降低。采用10%乙睛脱气后再与乙睛梯度混合，可降低检测噪音、减小柱压、提高测定精密度和重复性。
    6.6 取同一批丹参药材，分别用乙醇超声提取15 min，水浴回流提取30,60,90和120 min，以二氢丹参酮工、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IA色谱峰积分面积为提取量指标，证明60 min可提取完全，确定提取时间为60 min.

作者： 2006-3-27