不同产地红花药材的高效毛细管电泳指纹图谱研究中药指纹图谱 | 39康复网

   摘要：目的建立红花道地药材的高效毛细管电泳指纹图谱，并对不同产地红花药材的指纹图谱进行比较。方法以60%甲醇溶液提取，采用毛细管区带电泳法，运行电压24KV，运行缓冲液为50mmol/L!硼砂（pH9.7）其中含18%甲醇，以利福平为参照物（IS），建立了10批红花道地药材的指纹图谱，并与9个产地的红花药材以及红花的对照药材加以比较。结果在红花道地药材的指纹图谱中，共有峰的相对迁移时间的RSD<1.8%，相对峰面积的RSD<6.2%(n=5)。不同产地红花药材的指纹图谱中，共有峰的相对峰面积有一定的差别。结论:HPCE指纹图谱分析法可作为红花药材的质量控制方法。
    关键词：红花；高效毛细管电泳；指纹图谱

    红花(Carthamus tinctorius L).是菊科植物红花的干燥花，俗名草红花、红蓝花，是中医传统的活血化淤药。药理研究表明，它有降血压、降血脂、抗血栓等作用。对于红花的质量分析，有UV分光光度法测定黄色素和高效液相色谱法测定腺苷、黄酮醇，高效毛细管电泳法测定红色素和黄色素。运用高效毛细管电泳法（HPCE）对红花药材的指纹图谱进行研究，作者还未见报道。河南封丘、延津产的红花为道地药材，本研究运用HPCE建立了红花道地药材指纹图谱，并对9个产地及红花对照药材的指纹图谱进行了比较，为红花药材的质量评估提供一定的科学依据。
    1仪器与试药
    HP G1600A型高效毛细管电泳仪，美国，包括HP化学工作站，二级管阵列紫外检测器，自动进样器；AS5150A超声波清洗器（北京）。
    红花对照药材（中国药品生物制品检定所，批号907-9204；腺苷、芦丁、槲皮素、利福平（中国药品生物制品检定所）。甲醇（色谱纯），乙醇和硼砂（分析纯）。红花药材购自沈阳市药材公司，经沈阳药科大学孙启时教授鉴定为菊科植物Carthamus tinctorius L.的干燥花。
    2 方法与结果
    2.1 内标溶液的配制
    精密称取利福平0.2086g，用甲醇溶解并定容至100ml，摇匀。内标物在供试品溶液中的浓度约为200ug/ml。
    2.2 供试品溶液的配制
    精密称取干燥的红花粉末2.0g，加乙醇-水（60:40）24ml，超声提取30min，3000r/min离心10min，取上清液，重复提取2次，合并上清液，减压回收乙醇，残渣加内标溶液1.0ml，甲醇-水（60:40）定容至10ml，经0.45um滤膜滤过，作为供试品溶液。
    2.3 电泳条件
    未涂层石英毛细管50um×66.5cm，有效长度58cm（河北永年锐沣色谱器件有限公司）；检测波长：210nm；压力进样：5kPa,5s；分离电压：24kV；毛细管温度：20℃；运行缓冲液：50mmol/L!硼砂（pH9.7）并含有18%甲醇的缓冲液。毛细管柱使用前以1mol/L氢氧化钠溶液、重蒸馏水和运行缓冲液依次冲洗5,5,10min，每次电泳后以运行缓冲液冲洗8min。
    2.4 指纹图谱的建立
    2.4.1 共有指纹峰的确认按“2.2”项下制备10批河南封丘红花药材的供试液，每批进样2次，记录电泳图，共考察了66min，发现在48min后没有峰出现。经过对10批样品的测定，确定分离度好（Rf>1.5）和相对峰面积较大的峰作为共有指纹峰，共计12个，通过比较在线紫外吸收光谱和加入对照品溶液的方法，确认了4号峰为腺苷，7号峰为芦丁，10号峰为槲皮素，IS峰为利福平。以利福平为参照物，计算10批样品共有峰的相对迁移时间（共有峰与参照物峰迁移时间的比值）和相对峰面积（共有峰峰面积与参照物峰面积的比值）的均值见表1。实验结果表明，12个共有峰的相对迁移时间的RSD<0.88%，而相对峰面积的RSD<8.1%。
    2.4.3 重现性试验
    取1份供试品溶液，连续进样5次，以共有峰的相对迁移时间及相对峰面积计算，RSD分别不超过1.0%和5.5%。
    精密称取干燥的红花药材粉末5份，每份2.0g，依照“2.2”项下制备供试品溶液，并测定其指纹图谱，共有峰的相对迁移时间的RSD<1.8%，相对峰面积的RSD<6.2%。
    2.5 不同产地红花药材指纹图谱比较
    取9个产地的红花及红花对照药材（产地不详），按“2.2”项下制备供试品溶液，然后用HPCE进行测定，结果见表1，指纹谱见图2(略)。
    3讨论
    3.1取同样量的红花样品，依次用索氏提取法、超声提取法和煎煮法提取并制成供试品溶液，进行HPCE分析，以腺苷、芦丁的含量和峰数目的多少为考察指标，结果表明，索氏提取法和超声提取法效果最佳，由于超声法简便、省时，故本研究采用超声法作为红花药材的提取工艺。
    3.2 我们考察了不同浓度的硼砂溶液（10～100mmol/L）、磷酸盐溶液（10～100mmol/L）、不同pH值（3～10）以及加入有机改性剂的量（3%～30%）对分离的影响，其中以pH值和加入有机改性剂的量对分离的影响最大，pH值低于8时，几乎无法将各峰分开，而pH值在9～10之间对分离的影响不大；甲醇的加入量低于15%时，9,10,11 号峰均不能与相邻峰分离，而甲醇的加入量达到20%时，9和11号峰又不能与相邻峰分离。此外，还考察了不同波长下（210,354,350,403nm）峰检测灵敏度及峰数目的多少。结果表明，以50mmol/L硼砂（pH9.7）并且含18%甲醇为运行缓冲液，在210nm处所检测的峰数目最多，分离度最好。
    3.3 实验结果表明，9个产地红花和红花对照药材的指纹图谱与红花道地药材的指纹图谱的图貌基本一致，但各共有峰的相对峰面积有所不同，尤其是7,9,10,11,12号峰的相对峰面积差异显著；在这10个红花样品中，以对照药材中腺苷的含量最高，云南红花中芦丁和槲皮素的含量最高。这些都表明红花中各成分含量的差异与其生长环境密切相关，从而为科学地评价红花药材的质量提供了依据。

作者： 2006-3-27