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六味地黄丸指纹图谱的研究

来源:药分网
摘要:六味地黄丸是中医“滋补肾阴”的经典代表名方,由宋·钱乙在《小儿药证直诀》中首创,现广泛应用于临床。2000年版药典中明确规定,六味地黄丸仅以丹皮酚和熊果酸的含量作为质量控制指标,虽然此方法简单易行,但尚不能全面控制六味地黄丸的内在质量。为此,作者采用RP-HPLC法建立六味地黄丸的指纹图谱,确定各共有峰的归......

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    六味地黄丸是中医“滋补肾阴”的经典代表名方,由宋·钱乙在《小儿药证直诀》中首创,现广泛应用于临床。2000年版药典中明确规定,六味地黄丸仅以丹皮酚和熊果酸的含量作为质量控制指标,虽然此方法简单易行,但尚不能全面控制六味地黄丸的内在质量。为此,作者采用RP-HPLC法建立六味地黄丸的指纹图谱,确定各共有峰的归属,以便实现从多药物、多成分的系统化角度控制六味地黄丸的质量。
1 实验仪器及材料
    Waters高效液相色谱仪(600 Controller,600 pump,996 Photodiode Array Detector);H66MC型离心机;型超声震荡仪。马钱素(loganin)对照品由南京中医药大学提供;熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻均购于哈尔滨药材市场,经鉴定为正品;乙腈,HPLC级,美国迪马(DIKMA)试剂公司;其余试剂为分析纯。
2实验方法与结果
2.1色谱条件
    Water Symmetry Shield TM RP18色谱柱(3.9mm×150mm,5um);Nova-Pak C18 Guard-PakTM保护柱;柱温30℃;流速1ml/min;检测波长238nm7;乙腈-0.15%磷酸梯度洗脱:洗脱时间为130min,60min之内乙腈浓度由零升至12%,后70min乙腈浓度由12%升至30%。
2.2 检测波长的选择
    本实验采用二极管阵列检测器,在分析时进行全波长紫外扫描,并在不同波长下获取数据,经比较后表明238nm色谱图峰形最好,出峰数目适中,各色谱峰相互之间分离度较好,故检测波长定为238nm。
2.3 HPLC供试品溶液的制备
    按药典六味地黄丸处方称取药材,采用2000年版药典方法分别制成六味地黄丸、缺味六味地黄丸及单味丸,各称取1g,用10ml甲醇超声提取15min(2次),滤过,合并滤液,滤液干燥后用甲醇定容至10ml,溶液过0.45um微孔滤膜即得;另精密称取马钱素对照品1mg左右,置25ml容量瓶,加甲醇溶解并稀释至刻度摇匀得马钱素对照品溶液;上述样品备HPLC分析使用。
2.4 指纹图谱测定的方法学考察
2.4.1 精密度实验
    按样品制备方法制备六味地黄丸供试品溶液,连续进样5次,测定HPLC色谱图,结果各共有峰相对峰面积的RSD小于1%,相对保留时间的RSD小于1%。
表明仪器精密度良好。
2.4.2 稳定性实验
    按样品制备方法制备六味地黄丸供试品溶液,每6h进样分析,测定HPLC色谱图,结果各共有峰相对峰面积的RSD小于2%,相对保留时间的RSD小于2%。表明样品在24h内稳定性良好。
2.4.3 重复性实验
    按样品制备方法平行操作制备" 份六味地黄丸供试品溶液,测定HPLC色谱图,结果各共有峰相对峰面积的RSD小于3%,相对保留时间的RSD小于3%。表明方法重复性良好。
2.5 六味地黄丸指纹图谱的测定及技术参数
2.5.1指纹图谱的测定
    取10批六味地黄丸供试样品,按2.1项下条件进行HPLC分析,实现了峰与峰之间的良好分离,确定了10个共有峰(图1)。并取六味地黄丸、缺味地黄丸及单味丸样品,按相同条件进行HPLC分析认定峰来源。通过对照分析,认定共有峰1来源于熟地;共有峰2,4,6,7,8来源于山茱萸;共有峰3,5,9,10来源于牡丹皮;山药和茯苓对指纹图谱的共有峰没有贡献。
2.5.2 参照物的选择
    在HPLC图谱中选择峰面积较大、出峰时间适中且稳定的色谱峰作为参照峰,结果41.5min的色谱峰符合此条件,经对照品对照认定为马钱素的吸收峰,故选择马钱素作为参照物。
2.5.3 共有峰的相对保留时间相对峰面积指纹图谱相似度计算
    选取色谱图中的10强峰,由色谱工作站辅助自动进行峰匹配,确定10个共有峰。以马钱素色谱峰的保留时间和峰面积积分值为1,各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均在3%以内;以10个共有峰峰面积的均值做模板,利用“相关系数”法和“夹角余弦”法计算指纹图谱的相似度,结果见表1和表2,2种方法计算的相似度结果均在#0.99以上。
3 结论与讨论
    中药化学成分的多样性与复杂性是其发挥疗效的物质基础,也是质量评价的难点与重点。目前,大量中药在其有效成分尚未被阐明的情况下,只采用单一或少数几个成分做指标进行质量评价,往往不能全面反映其质量情况。本实验建立了六味地黄丸的HPLC指纹图谱,确定了10个共有峰,共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均在3%以内;利用“相关系数”法和“夹角余弦”法计算指纹图谱的相似度,结果均在0.99以上,上述结果表明所建立的指纹图谱的技术指标稳定,重现性好。在此基础上确认了各共有峰的归属。本实验结果能使六味地黄丸中尚不明确的众多成分由无序到有序,使各成分的来源明晰,并依其相对保留时间和相对峰面积等参数来客观地评价六味地黄丸的内在质量。
作者: 2006-3-27
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