丹参及丹参注射液指纹图谱的HPLC-MS研究中药指纹图谱 | 39康复网

摘要:目的采用HPLC-UV-MS法对丹参药材、丹参注射液中间体及丹参注射液进行指纹图谱的研究方法采用Alltima C18分析柱，甲醉水冰醋酸梯度洗脱系统，流速:I mL/min,检测波长:281nm.MS同时记录总离子流(TIC)色谱图。结果得到分离度较好的丹参药材、中间体及注射液的HPLC-UV及HPLC-MS指纹图谱。结论为丹参药材、中间体及注射液的质量控制提供全面、可靠的依据
关健词丹参;丹参注射液;指纹图谱,HPLC-UV;HPLC-MS
    指纹图谱是国际公认的控制中药或天然药物质量最有效的方式之一。在药效、毒理及临床研究试验等已经确定该品种安全有效的前提下凭借实用的指纹图谱(或图像)既可以确认该产品的真伪，同时又能判断质量的稳定性。丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiomhiza Bge的干燥根及根茎，性微寒味苦，具有活血化痕、凉血消肿、清心除烦之功效。现代药理学研究川表明丹参具有增加冠状动脉血流量、调血脂、抑制血栓形成和改善微循环等作用。丹参主要成分为水溶性酚性酸—丹参素、原儿茶醛，脂溶性二菇醒类一丹参酮II等。本实验采用HPLC-MS技术对丹参、丹参注射液中间体及丹参注射液所含成分进行分离，得到了分离度及重现性均较好的丹参及其制剂的指纹图谱，并对所含化学成分进行了MS归属.
1 仪器与试剂
    Agilent 1100LC/DAD/MS系统，含在线真空脱气机、高压二元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器(DAD)、电喷雾(ES)接口。HPChemstationR ev.A .0. 8. 03 .色谱工作站。
甲醇( 色谱纯)，冰醋酸(分析纯)，纯净水;丹参药材产自河南灵宝，经本校中药学院余伯阳教授鉴定为丹参S. miltiorrhiza Bge.;丹参注射液中间体、丹参注射液为国内某药厂生产。
2 方法与结果
2.1 供试品的制备:药材供试品的制备:取2.0 g丹参药材粉末(过40目筛)，加40 mL水，热回流2h,滤过，取滤液20 mL，加乙醇20 ml，放置12h,滤过，再用。0.45um微孔滤膜滤过后作为丹参药材供试品。
丹参注射液中间体供试品的制备:取丹参注射液中间体0.5 m l，用水稀释至50m l,0 .45 u m微孔滤膜滤过后作为丹参注射液中间体供试品。
丹参注射液供试品的制备:取丹参注射液，用0.45um微孔滤膜滤过后作为丹参注射液供试品
2. 2 液相色谱条件及分析方法:色谱柱:AlltimaC18柱(250mm×4.6mm,5um);流动相:甲醇一水冰醋酸梯度洗脱系统;流速:1 mL/min;柱温:25℃;检测波长:281 nm;柱后分流0.4 ml/min进质谱仪;MS同时记录总离子流(TIC)色潜图。离子极性:EST(-);扫描范围,80～800;干燥气流速:1ml/min;雾化室压:40psi;毛细管电压:4 kV;传输电压:70V。取供试品各20uL分别注人HPLC-MS联用仪进行测定。
2.3 试验结果:丹参药材、丹参注射液中间体及丹参注射液的HPLC-UV和HPLC-MS指纹图潜分别见图1,2.
3 讨论
3.1 HPLC-UV 指纹图谱:由图1可以看出丹参药材、中间体与注射液的指纹图谱有一定的相关性。但由于注射液在制备过程中受高温煎煮，一些成分发生变化，与药材温水浸取液所分离得到的成分有明显差异。在中问体和注射液中一些相对分子质量较大的成分含量相对较少，而中间体与注射液的指纹图谱之间有很好的相关性。我们对10批次的注射液进行了测定，确定了6个共有峰，以tR=14.3min的化合物为自身内标，计算相对保留时间分别为:0. 580士0.009, 0.683士0. 008, 2. 001士0.025,3. 757士0.060,4.098士0. 066。峰面积占总峰面积30%以上色谱峰共2个，其相对峰面积分别为:0.348士0,030,0-389士0. 054.用梯度洗脱法得到的丹参及其制剂HPLC-UV指纹图潜分离度、重现性好，可作为鉴别丹参药材真伪优劣和注射液质量控制的依据。

3.2 HPLC-MS指纹图谱:实验条件下，丹参供试品对质谱负离子检测有较好的响应。正离子检测信号较弱，这与丹参注射液中主要含有酚酸类化合物有关。根据化合物的质荷比及相关的文献，对图中的主要色谱峰进行了MS归属。丹参药材HPLC-MS色谱图中tR=9.8 min为丹参素，其[M-H]-为m/z197sH PLC-UV对照品试验表明tR=14.3min的化合物为原儿茶醛，相对分子质量为138，相同位置处MS谱图中出现原儿茶醛的m/z 137[M-H]-峰，其结果与对照品试验一致;tR=19.3 min处MS谱图中表现为m/z 179[M-H]-峰，推测为丹参素的脱水产物;tR=25.3min处为m/z 537[M-H]-峰，是紫草酸;tR=28.7min处的吸收峰是丹参药材HPLC-UV图中最大的吸收峰，相同保留时间处MS图中也有较大的吸收峰，为m/z717[M一H]-峰，并伴有m/z 739,519,359,197碎片，推测m/z717为丹参酸乙的[M-H]-峰;tR=30.5min处出现m/z 741(10000)峰，推测m/z741为紫草酸乙镁盐的[M-H]-峰。紫草酸乙镁盐是丹参中酚性酸的主要成分，具有纤溶作用和增强冠脉流量的作用;在tR=27.7,31.7min处，MS中均有m/z 493[M-H]-峰，且它们的碎片离子相似，推测为紫草酸中的二氢吱喃环开环后脱水脱狡，形成的一组顺反烯烃异构体.
    丹参中间体和注射液的HPLC-MS谱图较丹参药材少，在tR=9.8,14.3 min处分别出现m/z 197[M一H]-峰和m/z359[M一H]-峰，与药材HPLC-MS谱图相同。tR=28.7min处MS表现为m/z 359[M一H]-峰，为迷迭香酸，药材中无此峰。tR=28.7min处中间体和注射液HPLC-MS谱图中未出现丹参酸乙的m/z 717[M-H]-峰，但在tR=30. 5 min出现较强的紫草酸乙镁盐m/z 741[M-H]-峰。另外，药材HPLC-MS谱图中出现的丹参素脱水产物、紫草酸、紫草酸的脱水脱泼产物，在中间体和注射液的HPLC-MS谱图中均未出现，从而进一步说明了丹参在制备过程中所含成分发生了较大变化。我们正对上述化学成分做进一步确证。
    以MS作为检测器，可以将色谱的保留值、响应值与化合物的相对分子质量信息结合起来，实现对各主要流出组分的定性，为药材、中间体和成品制剂的鉴别及质量评价提供更加全面、可靠的依据

作者： 2006-3-27