苦参注射液生物碱类成分指纹图谱的研究中药指纹图谱 | 39康复网

［摘要］目的：建立中药苦参（包括药材、中间体及注射液成品）中生物碱类成分HPLC指纹图谱的测试方法。
方法：利用RP-HPLC采用线性梯度洗脱等进行指纹图谱的测定，并应用LC/MS技术指认指纹图谱中的主要色谱
峰。结果：获得了较为理想的中药苦参生物碱类成分的HPLC指纹图谱，比较了苦参药材、中间体及注射液成品间的相关性，根据HPLC所提供的分子量信息5个色谱峰被指认。结论：本法可得到精密度、重复性和稳定性较好的中药苦参生物碱类成分的HPLC指纹图谱，为中药苦参的质量控制提供有效手段。
［关键词］指纹图谱；苦参；生物碱
    苦参Sophora flavsecena Ait.是一种常用中药，为豆科槐属植物苦参的干燥根。具有清热利湿、祛风杀虫、抗肿瘤、抑菌等作用。苦参中主要含有生物碱、黄酮等化学成分，其有效成分为生物碱。从苦参中已分离出苦参碱、氧化苦参碱等多种生物碱成分。中药指纹图谱是近几年提出的、目前国际上公认的控制中药或天然药物质量的最有效的手段之一。本文采用HPLC-MS法对中药苦参中生物碱类成分进行了指纹图谱的研究。
1 实验部分
1.1 仪器与试药
    Agilent液相色谱. 质谱联用仪：具二元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、恒温柱箱、DAD检测器、电喷雾（ESI）接口、MSD 检测器、Agilent化学工作站。试剂：甲醇（色谱纯，美国Tedia公司）；醋酸铵（分析纯，南京化学试剂厂）；水为超纯水。
药材：苦参药材产自黑龙江泰康县（黑龙江医药工业研究所于喜水研究员鉴定）、苦参注射液中间体和注射液成品由黑龙江医药工业研究所提供。
1.2 实验方法
1.2.1 供试品的制备:药材样品处理取苦参药材粉末（过40目筛）约1g，置于150ml 圆底烧瓶中，加水50ml，回流1h（沸腾开始计时），用滤纸滤过，取续滤液放冷，经0.45um 的微孔滤膜滤过，即得供试品。
    中间体:称取中间体约100mg 置50ml 的容量瓶中，以流动相A溶解制成约2g/ml的溶液，然后经0.45um的微孔滤膜滤过，即得供试品。
    注射液:将注射液成品直接以0.45um 的微孔滤膜滤过，即得供试品。
取以上供试品各5ul分别注入LC/MS联用仪进行测定。
1.2.2 参照物:以指纹图谱中氧化苦参碱（保留时间约10min）作为指纹图谱的参照物。
1.2.3 色谱条件:色谱柱Zaorbax Extend-C18柱，2.1mm×50mm，5um。保护柱Zaorbax Extend-C18柱，2.1mm×12.5mm，5um。柱温25℃；流速0.5ml/min。检测波长220nm。记录时间60min。
    流动相A：0.01mol/L的醋酸铵水溶液，用浓氨水调pH8.0；B：0.0085mol/L的醋酸铵甲醇水溶液（甲醇-水=9:1），采用梯度洗脱：0%B(30min)→40%B(25min)→100%B(5min)(1min)→0%B(5min).
1.2.4质谱条件:MS记录总离子流（TLC）色谱图。离子扫描方式ESI（+）。质量扫描范围102～800amu。毛细管电压4000V。传输/裂解电压70V。干燥气（ N2）流速10L/min；干燥气压力279.5kPa；干燥气温度350℃。
2结果与讨论
2.1 药材提取方法
    考察了苦参药材的氯仿加浓氨溶液提取法、水提取法以及50%甲醇水溶液提取法。氯仿加浓氨溶液提取法和水提取法主要提取生物碱类成分，提取物相似。50%甲醇水溶液提取法则提取了生物碱和黄酮两大类成分。苦参的有效成分为生物碱，因指纹图谱主要考察与成品相关的类别成分，综合各方面的因素，苦参药材采用水作为提取溶剂。此法能最大限度地保留供试品中的生物碱类成分，提取方法简便、无毒且能保证药材与注射剂的指纹图谱具有相关性。
2.2 色谱条件的选择
2.2.1 检测波长的选择，苦参中所含的生物碱类化学成分在210～230nm范围紫外吸收较强，在210nm处吸收最强，但综合考虑其末端吸收的干扰，HPLC梯度洗脱中基线的稳定性等因素，我们选择220nm作为检测波长。
2.2.2 生物碱类物质因碱性较强，所以液相分离较困难。试验中曾试用过氨基柱Hypersil APS24.6mm×150mm,5um；ODS柱：Zobrax BONUS-RP4.6mm×150mm,5um和Zobra Extend-C182.1mm×50mm,5um柱。最后确定所使用的色谱柱为Zobra Extend-C182.1mm×50mm,5um柱。色谱条件如"1.2.3项下所示，指纹图谱中各色谱峰能达到较好的分离。
2.3 指纹图谱中参照物的选择
    用外标法对照可知，图谱中保留时间约为10min的色谱峰为氧化苦参碱，考虑到氧化苦参碱的标准品易得到，其色谱峰与其他峰分离良好，各批样品中均为主峰，且峰形稳定，保留时间适中，故采用此峰作为参照物峰。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验:取同一供试品溶液（药材、中间体、注射液），连续进样5次，考察色谱峰的相对保留时间和峰面积比值的一致性。试验结果表明各色谱峰的相对保留时间和峰面积比值的RSD值均小于3.0%，表明进样的精密度良好。
2.4.2稳定性试验:取同一供试品溶液（药材、中间体、注射液），分别在24h内不同时间段进样，考察色谱峰的相对保留时间和峰面积比值的一致性。试验结果表明各色谱峰的相对保留时间和峰面积比值的RSD值均小于3.0%，表明供试品溶液至少在24h内稳定。
2.4.3重复性试验:取同一批号的供试品5份（药材、中间体、注射液），按供试品的制备和检测方法制备供试品和进行检测，考察色谱峰的相对保留时间和峰面积比值的一致性。试验结果表明各色谱峰的相对保留时间和峰面积比值的RSD值均小于3.0%，表明其重复性良好。
2.5 中药苦参指纹图谱及其相关性
    图1为苦参药材、中间体、注射液的HPLC-UV指纹图谱。从图中可以看出，苦参药材中1，2，3，4，5 处的色谱峰在苦参中间体和注射液中的相应位置也存在这些色谱峰。由此可见，苦参药材、中间体和注射液指纹图谱之间存在相关性。
    分别对10批苦参药材、10批中间体、10批注射液的指纹图谱进行了测定，其各色谱峰的相对保留时间的RSD值均小于2.0%，峰面积比值也具有稳定性。
2.6 苦参指纹图谱中主要色谱峰的指认
    采用LC-ESI-MSD联用技术，我们指认了苦参药材指纹图谱中的5个色谱峰。图2为苦参药材、中间体、注射液的质谱的总离子流色谱图（TIC）。我们根据质谱所提供的分子量信息，结合文献报道，对指纹图谱中的主要色谱峰进行了归属，其质谱数据见表1。

作者： 2006-3-27