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中药指纹图谱
复方有效部位与组方药材指纹图谱色谱峰相关性研究
来源:药分网
摘要:摘要:目的在色谱指纹图谱分析的基础上,研究复方有效部位与组方药材指纹图谱色谱峰相关性,进而分析有效部位化学组成。方法以精制血府逐癣汤降血脂有效部位(FP)为研究对象,通过HPLC/DAD联用建立复方有效部位及各药材相应部位指纹图谱,以色谱峰保留时间相对偏差△t和紫外光谱相似度为考察指标,对方剂有效部位化学指纹图......
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摘要:目的在色谱
指纹图谱
分析的基础上,研究复方有效部位与组方药材指纹图谱色谱峰相关性,进而分析有效部位化学组成。方法以精制血府逐癣汤降血脂有效部位(FP)为研究对象,通过HPLC/DAD联用建立复方有效部位及各药材相应部位指纹图谱,以色谱峰保留时间相对偏差△t和紫外光谱相似度为考察指标,对方剂有效部位化学指纹图谱色谱峰归属进行分析。结果对复方有效部位FP中的16个色谱峰进行了归属分析,确定其主要来源于积壳、川曹、赤芍、红花,为黄酮及菇类化合物。结论该方法能较好地判别FP部位主要色谱峰与药材化学组分间的相关性,帮助确定FP部位指纹峰的归属,可应用于
中药
复方有效部位化学组成及来源分析。
关键词:中药复方;有效部位;指纹图谱;相关性
复方有效部位(群)是从复方中获取的化学类型明确、主要成分清楚且含量符合一定要求的物质群。我国1999年颁布的《新药审批办法》将复方有效部位列人中药二类新药范畴,要求其成分应有明确的归属,有效可控组分含量一般不低于50%。与单味中药或植物药相比,复方有效部位(群)新药更能体现中药独特的疗效,近年来越来越受到研究者的重视[t-21。为保持复方整体性,在复方有效部位化学研究中通常采用整方提取分离方法。在此过程中,各药材成分重新组合,使得有效部位的化学组分往往来源于组方中的多个药材,这就给成分鉴别和归属分析增加许多难度。采用传统植化方法对其进行系统成分分离无疑是一件费时费力的工作。现代分析技术,尤其是色谱技术的发展,提供了许多高效分离及多种检测方法,也使得中药整体组分的分离和指纹识别成为可能[3]。利用色谱方法获取复方有效部位及各药材的化学指纹图谱,通过指纹图谱中各相应色谱峰的相关性研究,建立部位与药材化学组成之间的联系,分析判别有效部位中各主要成分的来源,充分利用各药材已有的文献资料,获取有效部位中化学组成、化合物类型等多种信息。本实验以精制血府逐癖汤调节血脂代谢有效部位(FP)指纹图谱为研究对象,以色谱保留时间相对偏差和紫外光谱相似度为相关性考察指标,对该有效部位化学成分指纹图谱色谱峰归属进行研究。
1 仪器和试药
日本岛津LC一MAT高效液相色谱仪,CLASS一VP色谱处理系统,SPl一M10A二极管阵列检测器(DAD),SI L一10AD自动进样器。积壳(a)、赤芍(b)、川芍(c)、桃仁(d)、红花(e),柴胡(f)由中国中医研究院中药所黄璐琦研究员鉴定。甲醇(色谱纯);冰酯酸(分析纯);重蒸水。
2 方法和结果
2.1 供试品溶液的制备
FP部位供试品溶液的制备:全方加水煎提,提取液浓缩后上大孔吸附树脂柱,依次用水及不同浓度的乙醇梯度洗脱,收集40%一70%乙醇洗脱液,减压回收溶剂,60℃以下真空浓缩干燥,即得FP部位。取FP部位适量,以甲醇溶解,备用。
药材供试品溶液的制备:按处方量分别称取各药材,按FP部位相同制备方法处理,得FP.,FP b,FP ,F Pd,M 和FPf6个部位。分别称取适量样品,用甲醇溶解,备用。
2.2 色谱分析
ZORBAX-DSC C18色谱柱(4.6mm×250m m,5um);流动相A(0.5%酯酸水溶液),B(甲醇),线性梯度洗脱程序(min,B%):0.01m in,15 % ;80min,55%;柱温30℃;流速1.0M L.min一’;检测波长250 run.
2.3 指纹图谱获取
按"2. 1” 项下方法制备供试品溶液,按“2.2”项下梯度洗脱程序进行色谱分析,可获得全方FP部位以及组方药材的FPa,FPb,FPc,FPd,FPe和FP部位的指纹图谱。全方FP部位共标注了16个色谱指纹峰,如图1所示。各药材相应部位的指纹图谱见图2.
2.4 指纹图谱精密度实验
取FP部位以及FPa,FP b,FP c,R d,FE 、和FP部位供试品溶液,分别按,"2.2"项下色谱条件连续进样5次,对指纹图谱中色谱峰的保留时间进行考察,结果RSD小于1.1%;每日制备供试品溶液1份,连续5d,结果日间精密度RSD小于1.3%,精密度良好。
2.5 FP部位与药材谱峰相关性
采用 HPLC/DAD联用获取供试品指纹图谱,利用色谱峰保留时间相对偏差以及紫外光谱特征相似度为指标考察相关性,对有效部位化学指纹图谱的峰归属进行分析。步骤如下:
第一 步 : 从有效部位和各药材化学指纹图谱中获取谱峰的保留时间以及紫外光谱信息。
第 二 步 :根据有效部位指纹图谱中各谱峰保留值士2.5%设立窗口,在窗口范围内寻找匹配峰。
第三 步 :以 tR(FP)i表示FP部位第i个指纹峰(i=1,2,3,...’M)的保留时间;tR(hi)j表示药材h(h=a,b,c,d,e,f)指纹图谱中与FP部位第i个指纹峰相匹配色谱峰.1(J= 1 ,2, 3,...,p) 的 保留时间,以△IR(hi)j表示谱峰’R(hi)j与IR(FP)、的保留时间相对偏差,计算公式如下:
△t(hi)j=[tR(hi)j- tR(FP)]/ tR(FP)i
该值越接近于0,说明两谱峰相关性越强。
第四步 :采用夹角余弦法[4]计算对应色谱峰紫外光谱特征相似度。取色谱峰半峰宽以上光谱的均值进行计算,设谱峰tR(FP)i和IR(hi)j的光谱数据分别以n维向量x(xI ,x2 ,x3 ,......xn )和Y(y1,y2,y3........yn )表示,其中,xt(t=1,2,3,..., n)表示某波长下指纹峰tR(Fp)i的响应值,yt(t=1, 2, 3,...,n)表示某波长下谱峰IR(hi)j的响应值,。为采集的总波长数。(略)
3 讨论
3.1 相关性计算分析
色谱保留值可用于化合物定性鉴别分析,本实验采用保留值相对偏差△t作为考察指标之一,衡量相关性程度。从理论上讲,具有相同保留值的化合物并不一定为同一物质,加上实验过程中常有的色谱峰漂移现象,仅以△t定性分析可靠性不高。如与1号峰相匹配的791和D1色谱峰,仅以△t定性分析时,则应是D1和1号峰的相关性强,实际上,A1峰与1号峰的coso值更大,相关性更强。
为考察相关性计算结果的准确性,图3中列出了一些色谱峰的紫外光谱图。为更直观地考察谱峰的相关性,本实验将色谱峰的光谱图作如下变换:对每一物质,设置其光谱序列中最大吸收波长处的响应值为1,计算其他波长的相对响应值,如此得图示结果。图3a为3号峰与A3, B3的紫外光谱比较图。A3和B3相比,后者与3号峰的光谱更为相似,相关性计算结果也定量地表达出两者的相关性更强;同时,经对照品对照实验确认,3号峰为芍药昔,来自组方药材赤芍,计算结果与之相符。同样,4号峰为阿魏酸,来自川芍,10号峰、13号峰分别为袖皮昔、新橙皮昔,来自积壳,计算结果也相符,说明本实验采用的相关性计算方法结果的准确性。
图3b为15号峰与色谱峰B15的紫外光谱比较图,计算结果表明两者的相关性不够理想,究其原因,可能是有效部位FP中15号峰含量较低,基线或杂质的影响较大所致,但从峰谷值、峰尖值看两者重合较好,仍可判定巧号峰主要来源于色谱峰B15。
3.2 直观分析
除了通过计算△t及Cos值以数值形式定量地表达两谱峰的相关性大小,还可经“3.1”项下的尺度变换方法以图示形式直观描述谱峰紫外光谱的差异。图4中列出了4号峰和A4,C4 峰的紫外光谱图,图4a为直接从色谱工作站中获取的原始光谱图,图4b为经尺度变换所得的光谱图。从b可明显地看出,C4与4号峰的相关性大于A4,而从a中则很难辨认出A4和C4两者光谱特征的细微差别,说明经尺度变换后的紫外光谱图更易于直观分析两者之间的相关关系。
4 结论
本实验采用指纹图谱相关性分析方法,以保留时间相对偏差和紫外光谱信息作为相关性考察指标,对精制血府逐疲汤降血脂有效部位FP的来源及化学组成进行分析。研究结果表明,FP部位成分主要来自积壳、川芍、赤芍和红花等四味药材,含有芍药昔、抽皮昔、新橙皮昔、阿魏酸等成分,含量测定分析结果显示,FP部位中黄酮类、芍药总昔类占主要部分含量总和≥50%)。本实验提出的指纹图谱相关性分析方法可较为准确地判别复方有效部位指纹峰的归属,有助于快速确定有效部位的化学组成、来源和化合物种类;同时,结合有效部位药理学指标分析,又可以建立复方有效部位与相关药材药效活性间的联系,分析各药材在复方整体药效中的作用,对中药方剂的组方原理和配伍理论研究也具有积极意义。
作者: 2006-3-27
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