荒漠肉苁蓉的HPLC 指纹图谱研究中药指纹图谱 | 39康复网

摘　要: 目的　建立荒漠肉苁蓉C istanche d eserticola 的HPLC 指纹图谱, 评价不同来源的荒漠肉苁蓉药材的内在质量差异。方法　采用HPLC 梯度洗脱的方法建立指纹图谱,“计算机辅助相似度评价系统”软件进行数据处理, 据此对不同来源的药材进行比较分析。结果　方法精密度、稳定性、重现性较好; 不同来源的药材指纹图谱差异较大。结论　不同来源的荒漠肉苁蓉药材的内在质量差异较大, 该方法可用于评价肉苁蓉药材的质量。
关键词: 荒漠肉苁蓉; 指纹图谱; HPLC

肉苁蓉为列当科多年生寄生植物, 主要寄生于固沙植物梭梭、柽柳、盐爪爪、珍珠柴等的根部, 分布于沙漠、荒漠等干旱地带, 我国的内蒙古、新疆、甘肃和宁夏一带多有分布[ 1 ]。肉苁蓉具有极高的药用价值, 有“沙漠人参”之美誉, 是我国传统的名贵中药材。肉苁蓉主要含苯乙醇苷类、环烯醚萜及其苷类、木脂素苷类、多元醇、多糖等成分, 其中苯乙醇苷类为其补肾阳主要有效成分[ 2 ]。前期研究表明, 因来源、产地不同, 肉苁蓉药材有效成分的种类和含量有一定的差异[ 3 ]。为了有效控制肉苁蓉药材的质量, 本实验在建立肉苁蓉药材指纹图谱检测方法的基础上, 对《中华人民共和国药典》2000 年版一部收载的肉苁蓉即荒漠肉苁蓉C istanche d eserticola Y. C.
M a 进行了系统的指纹图谱研究, 考察了不同来源肉苁蓉药材内在品质的差异, 为肉苁蓉的质量控制提供依据。
1　仪器和材料
Agilen t 1100 series 型高效液相色谱仪: 四元泵、在线脱气机、柱温箱、自动进样器、DAD 检测器( 美国安捷伦公司) , 旋转蒸发仪(日本EYELA 公司)。松果菊苷(ech inaco side) 和洋丁香酚苷(类叶升麻苷, acteo side) 对照品均由北京大学药学院天然药物学系制备, 纯度均大于95%。乙腈为色谱纯, 水为高纯水, 甲醇、磷酸为分析纯。肉苁蓉药材由北京大学药学院屠鹏飞教授鉴定为荒漠肉苁蓉C. d e.serticola Y. C.M a 的干燥肉质茎。药材来源见表1。
2　方法与结果
2.1　色谱条件: 色谱柱为A gilen t Zo rbar Ex tend-C18 (150mm ×4.6mm , 5um) ; 检测波长330 nm; 体积流量: 1 mL/min; 柱温为30℃; 流动相: A 相为0.095% 磷酸水溶液, B 相为0.095% 磷酸乙腈溶液, 线性梯度洗脱, 0～18 m in, 96%A -4%B; 18～40m in, 88%A -12%B; 40～65 m in, 85%A-15%B;65～ 75 m in, 85%A -15%B; 75～ 90 m in, 80%A -20%B; 90～ 100 m in, 80%A -20%B; 100 m in, 96%A -4%B。
2.2　流动相以及洗脱梯度的选择: 文献报道采用乙腈-醋酸系统作为流动相检测肉苁蓉药材。由于肉苁蓉成分复杂, 在文献方法采用的梯度条件下, 存在色谱峰重叠的情况。另外, 醋酸体积分数较高, 长期使用影响色谱柱的使用寿命。因此, 比较了甲醇-水系统、乙腈2水系统, 最后确定了0.095% 乙腈-0.095%磷酸水溶液系统(pH 约为2.3) 作为流动相。经试验采用梯度进行洗脱, 得到的信息量较丰富, 各成分峰形尖锐且分离度良好。
2.3　检测波长的选择: 利用DAD 检测器的全波长扫描, 在210～ 380 nm 选取不同波长, 比较肉苁蓉药材在230、280、330、370 nm 不同检测波长下的HPLC 图谱。结果表明: 在330 nm 处, 色谱峰信息最多, 且各峰分离良好。
2.4　供试品溶液的制备: 将肉苁蓉样品粉碎, 过60目筛, 精密称取药材粉末约1.0 g, 用甲醇超声提取3 次(30、20、20 mL ) , 每次15 m in。滤过, 合并滤液,浓缩至干。用10% 乙腈定容至10.0mL ,摇匀, 0.45um 滤膜滤过, 取续滤液, 即得。
2.5　数据处理软件的使用: 使用中南大学开发的“计算机辅助相似度评价系统”软件进行数据处理。该软件可将多个色谱图进行汇总比较, 经计算机辅助计算得到可全面反映多个色谱图特征的对照模式色谱图, 并以此模式为基准, 计算每个色谱图与之比较的相似度。本实验采用相关系数(均数) 进行评价。
2.6　精密度试验: 取同一个肉苁蓉供试样品, 制备供试品溶液, 连续进样5 次, 检测指纹图谱,“计算机辅助相似性评价系统”进行评价, 结果都在0.98 以上(n= 5) , 表明仪器的精密度良好。
2.7　稳定性试验: 取同一个肉苁蓉供试样品, 制备供试品溶液, 分别在0、2、4、8、16、24 h 进样, 检测指纹图谱,“计算机辅助相似性评价系统”进行评价, 结果都在0.98 以上(n= 6) , 表明样品的稳定性良好。
2.8　重现性试验: 取同一批肉苁蓉药材5 份, 分别精密称定, 制备供试品溶液, 分别进样, 检测指纹图谱,“计算机辅助相似性评价系统”进行评价, 结果都在0.98 以上(n= 5) , 表明方法重现性较好。
2.9　样品分析: 精密吸取供试品溶液10uL , 注入液相色谱仪, 采集100m in 的HPLC 图谱, 其主要色谱峰的保留时间见表2, 色谱图见图1。不同来源的荒漠肉苁蓉指纹图谱见图2。经“计算机辅助相似度评价系统”软件进行数据处理, 结果见表3。
3　讨论
3.1　对不同产地的荒漠肉苁蓉的指纹图谱进行分析可以看出, 其指纹图谱具有以下特征: (1) 在保留时间35～ 53 m in 有3 个明显的色谱峰, 其中7 号峰( 松果菊苷, 保留时间约35 m in) 和9 号峰(洋丁香酚苷, 保留时间约52 m in) 为相对峰面积较大的色谱峰, 8 号峰(肉苁蓉苷A , 保留时间约45 m in) 峰面积一般小于7 号和9 号峰, 形成两边高中间低的明显特征峰。在化学结构上, 因松果菊苷比洋丁香酚苷多连接一个糖, 易发生水解, 转化为洋丁香酚苷, 如果药材干燥时间长或霉变, 则7 号峰降低, 而9 号峰升高。(2) 1 号峰和2 号峰分别为2 个色谱峰组成,有时两峰未达到基线分离。此两峰为国产荒漠肉苁蓉的特征峰。
3.2　不同来源的荒漠肉苁蓉指纹图谱差异较大。首先, 不同药材色谱峰峰数有明显差异, 有些样品出现特征峰的缺失, 说明化合物的种类有明显差异; 其次, 信号强度差异很大, 信号范围从50 到2 500mAU 不等, 说明所含化合物差异很大。其中购自新疆乌鲁木齐药材市场的样品(6 号) 和哈萨克斯坦进口的样品(14 号) 色谱图中, 松果菊苷和洋丁香酚苷对照品峰信号很低, 与大多数药材有明显差异; 而宁夏甘草种植场栽培的样品(9、10 号) , 松果菊苷量极高, 这可能与栽培场的药材干燥速度快, 松果菊苷未发生转化有关。产地相同的不同药材, 如阿拉善左旗张泰乡的样品(11～ 13 号) 也有较大差异, 提示除产地来源外, 还有其他因素影响肉苁蓉的质量。
3.3　肉苁蓉中含有苯乙醇苷类化合物, 其中以松果菊苷和洋丁香酚苷的量较高, 并且为重要的活性成分, 以这2 个化合物为对照品, 可以很好地代表肉苁蓉药理作用的化学物质基础, 使药材的质量评价与其药理作用能够彼此对应, 提高了质量评价的针对性。
3.4　由指纹图谱可见各峰分离较好, 实验中利用DAD 检测器采用归一化比较法对HPLC 图中主要色谱峰进行纯度检查, 结果显示各主要峰纯度较好,故本方法除了可以用于定性考察药材质量外, 也可用于多种单一成分的一次同时定量检测, 使测定更加简便快捷。

作者： 2006-3-27