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摘要: 目的:研究建立菊花HPLC 指纹图谱分析法, 评价不同品种不同来源菊花药材的质量。方法 采用梯度洗脱的方法进行色谱分离, 用竞争层神经网络进行数据处理, 对不同品种、不同来源的菊花样本进行模式识别。结果:建立了菊花的HPLC 指纹图谱分析方法, 识别结果将菊花样本分为5 类。结论 利用菊花指纹图谱可对不同品种不同来源的菊花药材进行鉴别, 并可在-1定程度上进行质量控制。
关键词: 菊花; HPLC; 指纹图谱; 竞争层神经网络
菊花为菊科多年生草本植物菊Ch ry san them umm orif olium Ram at1 的头状花序, 具有疏风清热、平肝明目的功效, 其主要成分为黄酮类、挥发油、氨基酸、微量元素等。菊花总黄酮具有降血压、扩张冠状动脉、防止冠脉粥样硬化等作用, 其中木犀草素及其苷类以及芹菜素具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤及扩张血管等药理作用[ 1～ 3 ]。目前对菊花的研究多集中在某单-1有效成分的提取和测定上, 而中医药理论强调中药所含的某-1种活性成分均不能代表其整体的疗效。本实验采用HPLC 法建立了菊花的指纹图谱,并用竞争层(compet it ive layer) 神经网络对不同来源的菊花样本进行模式识别, 为菊花药材的品种鉴定和质量控制提供科学依据。
1 仪器与试药
A gilen t 1100 高效液相色谱系统, DAD 检测器, A gilen t 色谱工作站; R201 旋转蒸发器(上海申生科技有限公司) ; KQ —50 型超声波清洗器(昆山市淀山湖检测仪器厂) ; 索氏提取装置;MA TLAB6. 5 处理软件。
甲醇为色谱纯; 水为二次重蒸水; 其他试剂均为分析纯; 木犀草素、芹菜素对照品购于中国药品生物制品检定所; 菊花样品来源见表1, 均经河南中医学院生药教研室鉴定。样品置烘箱内50～ 60 ℃干燥2h, 粉碎后过40 目筛备用。
2 方法与结果
2.1 色谱条件: 色谱柱: Zo rbax SB C18 柱(200 mm ×4. 6 mm , 5μm )。流动相: A 为甲醇-水(15∶85)、B 为甲醇-水(52∶48) , 从A 到B 进行30m in 线性梯度洗脱, 然后在B 流动相条件下保持30m in。体积流量: 0. 7 mL/m in; 柱温: 25 ℃; 进样量:10μL; 分析时间: 60m in; 检测波长: 350 nm。在上述色谱条件下杭菊花色谱指纹图见图1。
2.2 样品溶液的制备: 取各药材样品2. 003 g 置圆底烧瓶中, 加95% 乙醇40 mL , 回流提取2 次, 每次2 h , 合并提取液, 滤过, 挥干乙醇, 加水溶解, 再用80 mL 醋酸乙酯分4 次萃取, 挥干醋酸乙酯, 用甲醇溶解, 定容至50 mL 量瓶中, 经0. 45μm 微孔滤膜滤过, 取续滤液即得。
2.3 对照品溶液的制备: 精密称取木樨草素、芹菜素对照品适量, 分别用甲醇溶解定容, 得对照品溶液, 浓度分别为木犀草素0. 000 6 mo l/L , 芹菜素0. 002 mo l/L 。
2.4 色谱指纹峰的标定: 以参照物木犀草素对应的色谱峰的保留时间和峰面积为1, 计算其他各色谱指纹峰的相对保留时间及相对峰面积。
2.5 精密度试验: 取同-1菊花样品溶液, 连续进样5 次, 按上述条件进行检测, 各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 分别为0. 1%～ 0. 8%和1. 5%～ 2. 8%。
2.6 重现性试验: 取同-1菊花样品, 分别制备5 份样品溶液进行检测, 各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 分别为0. 2%～ 1. 1%和2. 2%～ 4. 2%。
2.7 稳定性试验: 取同-1份菊花药材的供试品溶液在0、4、6、12、24 h 按上述条件进行检测, 各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 分别为0. 1%～ 2. 5% 和1. 7%～ 3. 7%。
2.8 样品测定: 按供试品溶液的制备方法, 在上述色谱条件下对16 个菊花样品进行测定, 各样品的相对保留时间见表2, 相对峰面积见表3。
2.9 信息处理: 用竞争层神经网络在MA TLAB 平台对所得的色谱信息进行处理, 竞争层神经网络为单层网络, 网络传递函数为竞争函数。对于本实验所采用的竞争层网络, 相关函数如下: 权值函数为negdist, 输入函数为net sum 函数, 传递函数为compet 函数, 网络用t rain 函数训练, 输入相对保留时间和相对峰面积值(数据经过适当处理) , 结果分为5类: 1～ 5 号样品为-1类; 6 号样品为-1类; 7、8、12、13号样品为-1类; 9～ 11 号、16 号样品为-1类; 14、15 号样品为-1类。
3 讨论
3.1 本实验以木犀草素对照品的最大吸收波长350、254 nm 为指标进行检测波长的考察, 结果发现254 nm 处的色谱图中基线漂移较大, 且峰数少, 故为获取更多信息, 选取350 nm 作为菊花指纹图谱的检测波长。同时进行了乙醇回流提取、乙醇回流提取-醋酸乙酯萃取、超声波提取、酸解提取、索氏提取等提取方法的考察, 结果表明乙醇回流提取-醋酸乙酯萃取法所得色谱图中色谱峰峰数较多、峰分离比较好、且主峰强度较高, 所以选取乙醇回流提取-醋酸乙酯萃取法来制备样品溶液。
3.2 建立了菊花药材指纹图谱的HPLC 测定法, 该方法能使菊花提取液中的大部分化学成分得到较好分离, 具有很好的稳定性、重现性和可行性。其中木犀草素和芹菜素已确证为菊花中的药效成分, 但由于对照品的匮乏, 无法判定菊花样品图1 中1～ 17号各峰所代表的物质成分, 尚需进行进-1步的研究。
3.3 杭菊酸水解后仅有木犀草素和芹菜素两个主要色谱峰, 且它们的量远远高于未水解时, 表明杭菊中黄酮类成分主要为以木犀草素和芹菜素为苷元的黄酮苷类化合物, 酸解后黄酮苷类化合物发生分解,从而形成游离的苷元。
3.4 竞争层神经网络在样本类别大致可知的情况下, 可以无须学习样本即可对数据进行分类, 在样本量不是太多的情况下较为适用。按HPLC 色谱峰相对保留时间和相对峰面积, 用compet it ive layer 神经网络可将样品分为5 类: 即1～ 5 号杭菊为1 类, 6 号杭菊为-1类, 贡菊、野金菊为-1类, 药菊、怀菊与金菊为-1类, 野菊花为-1类, 与实际样本基本-1致。因此用compet it ive layer 神经网络可以对菊花药材的种类进行模式识别, 从而为菊花资源的开发利用提供科学依据。
3.5 不同品种的菊花指纹图谱差异较为明显, 同-1品种的菊花指纹图的整体概貌是-1致的, 但各色谱峰的强度有差异。药菊、怀菊的色谱图相似, 这与文献报道药菊可能起源于河南的怀菊[ 4 ]是-1致的; 且二者色谱图中各色谱峰均较强, 尤其木犀草素和芹菜素的量在这几个菊花品种中为最高, 这为临床上药菊、怀菊主要药用, 而杭菊、贡菊为药茶兼用提供了依据。金菊花是菊科植物神农香菊与菊花的杂交新品种[ 4 ] , 从模式识别结果上可以推测金菊花与怀菊、药菊有较类似的药理作用, 但尚需进-1步的实验来论证。
References:
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作者:赵玉丛, 刘国际, 任保增, 屈凌波