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桂枝HPLC 指纹图谱的研究

来源:药物分析网
摘要:摘要:目的建立桂枝的HPLC指纹图谱,为控制药材质量提供科学方法。结果本研究测定了43个不同产地、不同采收季节的桂枝样品,其中共有峰的面积为10个,且方法学考察符合标准规定,采用系统聚类分析,将43个样品分为优质品、一般品和劣品。结论方法简便准确,可作为控制桂枝质量的有效依据。关键词:桂枝。...

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摘要:目的 建立桂枝的HPLC指纹图谱,为控制药材质量提供科学方法。方法 以Luna C18 (4. 6mm ×250mm ,5μm) 为色谱柱,乙腈20. 1 %磷酸(28∶72) 为流动相,检测波长285nm ,流速1ml/ min ,柱温30 ℃。结果 本研究测定了43 个不同产地、不同采收季节的桂枝样品,其中共有峰的面积为10 个,且方法学考察符合标准规定,采用系统聚类分析,将43 个样品分为优质品、一般品和劣品。结论 方法简便准确,可作为控制桂枝质量的有效依据。
关键词:桂枝;HPLC;指纹图谱

    桂枝主产于广东、广西,为樟科植物肉桂的干燥嫩枝,始载于《神农本草经》,属辛温解表药,具有发汗解肌、温通经脉、助阳化气、平冲降气之功效。用于风寒感冒、脘腹冷痛、血寒经闭、关节痹痛、痰饮、水肿、心悸等症。桂枝的主要有效成分为桂皮醛、桂皮酸、桂皮醇、香豆素及原儿茶酸等,药理研究表明:桂皮酸具有抗菌、消炎作用,桂皮醛有明显的镇静、镇痛作用[1 ] 。目前,药典以显微鉴别和桂皮醛的薄层鉴别来控制桂枝的质量[2 ] ,但这样无法反映桂枝中其他成分的情况及活性成分的含量。本实验采用HPLC 法建立了43 个桂枝样品甲醇提取液的指纹图谱,并用系统聚类法将其分类,并考察了桂枝品质与产地及采收季节之间的关系,为全面控制桂枝的质量提供了依据。
1  仪器与试药
LC-4A 高效液相色谱仪;SPD-2AS 紫外检测器;C-R3A 色谱数据处理机(均为日本岛津制作所) ;对照品桂皮醛(纯度98. 6 %) 、桂皮酸(纯度99. 2 %)(均购自中国药品生物制品检定所) ;对照品桂皮醇(纯度98. 5 %) 、香豆素(纯度99. 3 %) 、苯甲酸钠(纯度99. 0 % ,美国Chemsevice 公司) ;乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯。桂枝药材由广东、广西、云南等地采集,经九江森林植物研究所谭策铭老师鉴定。桂枝药材来源及采收季节,见表1。
2  方法和结果
2. 1  色谱条件:色谱柱:Luna C18 (250mm ×4. 6mm ,5μm) ; 流动相: 乙腈-0. 1 %磷酸(28 ∶72) ; 流速: 1.0ml/min ; 检测波长: 285nm; 柱温: 室温; 进样量:20μL。
2. 2  溶液的制备:内标液的制备:精密称定苯甲酸钠300mg ,置100ml 量瓶中,加入甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成内标液。
供试品溶液的制备:精密称定桂枝样品1. 0g ,置于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50ml ,称重,超声提取40min ,取出,待冷却后称重,用甲醇补足减失重量。精密加入内标溶液1. 0ml ,混匀后用微孔滤
膜滤过,取续滤液备用。
对照品溶液的制备:精密称取桂皮酸对照品5mg、桂皮醛对照品10mg、香豆素对照品3mg、桂皮醇对照品10mg ,置于25ml 棕色量瓶中,精密移取内标溶液1. 0ml ,加入甲醇稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜滤过,取续滤液备用。
2. 3  系统适用性试验:取对照品溶液进样分析,在2. 1 项色谱条件下得到良好分离,理论板数以桂皮酸峰计不低于15 000 ,各峰间分离度均大于1. 5 ,拖尾因子介于0. 95~1. 05 。在此色谱条件下对照品及样品的HPLC 图谱见图1。
2. 4  精密度试验:精密称取39 号样品,按供试品溶液制备方法操作,连续进样5 次,记录图谱。结果表明,各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值基本一致( RSD 为0. 72 %~1. 8 %) ,符合指纹图谱要求。
2. 5  重现性试验:精密称取39 号样品5 份,按供试品溶液制备方法操作,进样,记录图谱。结果表明,各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值基本一致( RSD 为1. 1 %~2. 5 %) ,符合指纹图谱要求。
2. 6  稳定性试验:精密称取桂枝对照药材,按供试品溶液制备方法操作,分别在0 ,1 ,2 ,4 ,8h 测定,记录图谱。结果表明,各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值基本一致( RSD 为l . 6 %~2. 8 %) ,符合指纹图谱要求。
2. 7  样品的指纹图谱测定:取不同产地、不同采收季节的桂枝样品测定,记录色谱峰。用各色谱峰对内标峰的相对保留时间定性,按下式计算各色谱峰相对于内标物的含量。
2. 8  桂枝的质量评价:
(1) 系统聚类分析:聚类分析是体现“物以类聚”的一种多元统计方法,是属于多元统计分析范畴,可用于以连续型变量表征的样本分类[3 ] 。可依据所测样品的数据,对样品进行分类。本研究共收集了43 个桂枝样品,用HPLC 法对每个样品的甲醇提取物进行了分析,得到其指纹图谱,获得包括桂皮醛、桂皮酸、桂皮醇、香豆素、甲氧基桂皮醛在内的10 个色谱峰。将这10 个色谱峰的峰面积对内标峰的峰面积按2. 7 项下公式进行量化,得到一个10 ×43 阶的数据矩阵,该矩阵代表了在10 维特征空间中分布着43 个样品,同类样品相聚集,异类样品相分离,选用欧氏距离作为样品间的相似性测度,采用可变类平均法进行聚类。聚类结果见图2。
 31 、33 、35 、34 、40 、17 、43 、3、16 、21 、42 、24 、15 、19 、37 、41 、36 、26 号样品被聚为一类,为质量一般的桂枝;1、7、28 、29 、5、8、2、14 、13 、32 、38 、6、12 、11 、39 、4、30 、20 、22 、23 、18 、25 、27 、9 号被聚为一类,为质量较好的一类;10 号为质量较差的一类。对未知样品进行鉴别时,只需将反映其化学成分信息的数据输入,即可对其优劣进行判别。
(2) 相似度分析:指纹图谱反映的是样品整体的特征,进行指纹图谱比较,可以反映样品之间的亲疏程度,但是单纯的直观比较指纹图谱峰的多少和峰的大小,只是定性比较,而且又带有个人的主观性。相似度可以定量的描述指纹图谱,本试验用相似度分析对样品进行了比较,可以定量的、客观的对样品进行评价。选取聚类分析和生药学鉴定中质量均较好的1、4、7、11 、12 、14 、18 、22 、23 、28 、29 、39 号样品为模板,计算出其空间向量中心,以欧氏距离为相似度测度,计算43 个桂枝样品图谱的相似度。其计算结果见表2。
3  结果与讨论
3. 1  本研究用HPLC 法分析了不同产地、不同采收季节的43 个桂枝样品的甲醇提取物,使每个样品中包括桂皮醛、桂皮酸、桂皮醇、香豆素、甲氧基桂皮醛在内的10 个色谱峰得到了较好的分离。将各色谱峰面积对内标峰峰面积进行量化,获得了10 ×43 阶的数据矩阵。用系统聚类分析进行了数据处理,并结合生药学鉴定将桂枝样品分为三类:优质品、一般品和劣品。根据聚类分析结果及生药学鉴定,选取12 个质量较好的桂枝样品为模板,计算其空间向量中心,以欧氏距离为相似度测度,计算了43 个桂枝样品的相似度,结果与聚类分析结果相一致,即相似度越高的样品其质量也越好。桂枝的主产地为广东和广西,云南也有少量出产。由质量分级的结果看,7、11 、12 、13 、23 这些优质品主要集中于广西十万大山一带的县乡,由于我国的桂树均由越南引种,十万大山一带的海拔较高,气候和地理条件与越南相似,比较适合于桂树生长。聚类分析的结果与传统的经验评判相一致。
3. 2  一般商品桂枝,规范的采收季节应为秋季,秋季砍树剥皮,枝条晾晒加工成桂枝。但目前,一年四季均可采摘。聚类分析的结果表明,春季产桂枝4、13 、14 、18 、20 、22 、23 、25 、28 、30 、32 号,秋季产桂枝1、2、5、11 、12 、27 、38 号品质均较好,春季产桂枝的结论与传统经验有些出入,尚需用能够反映临床疗效的药理实验来验证。
3. 3  本研究在中医药理论和实践的指导下,将生药学、分析化学、统计学和计算机科学相结合,建立了桂枝质量评价的化学模式识别方法,对只用化学数据判断中药材质量的方法进行了有益的尝试,对其它中药材的质量评价具有一定的参考价值。
3. 4  本研究进行了梯度洗脱法和等度洗脱法的比较试验,结果表明,采用梯度洗脱法得到的色谱峰与等度洗脱得到的色谱峰比较,数目并未见明显增加,而且采用等度洗脱各活性成分均能得出峰且分离度良好,因此本文采用等度洗脱。具有重现性好,节省分析时间的优点。

参考文献:
[1 ]  江苏新医学院. 中药大辞典[M] . 上海:上海科学技术出版社,2001. 1771~1773
[2 ]  国家药典委员会. 中国人民共和国药典(一部) [ S] . 北京:化学工业出版社,2000. 224~225
[3 ]  洪 楠. SPSS for Windows 统计分析教程[M] . 北京:电子工业出版社,2000. 184~192 ;203~232

作者:杨松 ,鲁曼华 ,毕开顺
来源:解放军药学学报 第21 卷第3 期

作者: 2006-3-27
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