规范化种植穿心莲药材HPLC指纹图谱研究

摘要:目的为规范化种植穿心莲药材质量研究提供新的基拙研究资料。方法RP-HPLC建立穿心莲指纹图谱，并进行不同种植基地(产地)与商品药材、不同生长期、不同药用部位指纹图谱的比较，采用计算机辅助的相似度评价软件进行相似度评价。结果在选定的色谱条件下，226nm检测波长下的巧个峰构成穿心莲药材的指纹特征，各批次样品指纹图谱均具有上述特征，但特征峰的相对含量分布差异导致色谱概貌存在一定差异。计算机辅助相似度评价，5个规范化种植基地产穿心莲药材指纹特征相互间较为吻合，具有较好的一致性，商品药材则差异较大。不同生长期药材指纹图谱也具有较好的一致性，多数特征峰含量呈现随生长期而增加的动态累积过程，不同部位则特征峰的含量分布叶中大大高于茎。结论实行规范化种植对于保证药材质量的稳定性具有重要的意义，所建立的方法可较全面地反映穿心莲药材多成分特征，并进行药材质量评价。
    关键词:穿心莲;指纹图谱;质量研究
    穿心莲为爵床科植物Andrographisp aniculata(Burm.f.)Nees.的干燥地上部分，具有清热解毒、凉血、消肿等作用，用于感冒发热，咽喉肿痛等症。其有效成分主要为二菇内酯类成分，穿心莲药材及其复方制剂多以该类成分中含量较大的穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量作为质量控制指标。由于产地、采收期等的不同，上述两成分含量差异较大，导致穿心莲药材质量不稳定。我们曾报道规范化种植穿心莲药材内酯成分的动态变化，为确定其最佳采收期提供了科学依据。本实验研究指纹图谱，为规范化种植穿心莲药材质量研究及评价提供新资料。
1 仪器、试药与实验材料
    HP 1100Series高效液相色谱仪(美国Agilent)，配置二极管阵列检测器及HP Chem Station 4.0色谱工作站。液相用甲醇、乙睛为色谱纯，其余试剂均为国产分析纯。穿心莲宁、脱水穿心莲内酯、脱氧穿心莲内酯、异穿心莲内酯、穿心莲内酯及新心莲内酯为自穿心莲中分离得到，经光谱学鉴定，经面积归一划法测定纯度为98%以上。
2 方法
2.1 供试品溶液制备：精密称取穿心莲干燥粉末2.0g ，甲醇50mL超声波振荡提取30 min，提取液浓缩至干，加水20mL溶解，以酯酸乙酯萃取，萃取液蒸干，残渣以甲醇溶解并定容至5 mL。进样前以0.2um微孔滤膜过滤，进样2ul。
2.2 对照品溶液制备：分别取脱水穿心莲内酯、脱氧穿心莲内酯、异穿心莲内酯、穿心莲内酯、新穿心莲内酯各约5mg精密称定，以甲醇溶解并定容至5 mL，分别精密吸取1mL混合，备用，进样前以0.2 um的微孔滤膜过滤。进样10汕。
2.3 色谱条件：Kromasil RP-18( 4.6mm×250mm,5um)色谱柱;乙腈-水梯度洗脱;25℃柱温;226 nm波长检测。
2.4 方法学考察
2.4.1 稳定性考察：取同一批次供试品溶液(HY-0820A)分别于0,2,4,8,10,24 h进样测定，比较色谱峰保留时间，主要色谱峰保留时间的RSI)在0.08%～0.150%。同时考察1～15的特征色谱峰的表观丰度，各特征峰表观丰度无明显差异，表明供试品溶液在24 h内均稳定。
2.4.2 仪器精密度实验：取同一份供试品溶液(HY-0820A )连续进样5次，比较色谱峰保留时间，主要色谱峰保留时间的RSD在0.08%～0.50%，同时考察1～15的特征色谱峰的表观丰度。
2.4.3 重复性实验：取同一批号的供试品(HY-0820A)5 份，同法制备供试品溶液，进样测定比较色谱峰保留时间，主要色谱峰保留时间的RSD在0.033%一0.707%a。同时考察1-15的特征色谱峰的表观丰度，表明所建立的方法具有较好的重复性。
3 结果与分析
3.1 穿心莲特征峰辨认与指纹图谱的建立
    详细比较多批次样品的色谱图，确定巧个特征峰构成穿心莲的指纹图谱，为便于分析，将整个色谱图谱分成I，II, III 3 组。第I组包括1～6号峰(保留时间10～25min);第11组7～12号峰(30～45 min)，其中7号峰为穿心莲内酯,9号峰为异穿心莲内酯;第IQ组13～15号峰(45～50m in),13号峰为新穿心莲内酯,14号峰为脱氧穿心莲内酯,15号峰为脱水穿心莲内酯。
3.2 穿心莲HPLC指纹图谱分析
    测试样品包括了不同生长期、不同产地、不同药用部位及商品药材，但其HPLC指纹图谱均具有上述的特征，相互间较为吻合，可以作为穿心莲药材的特征指纹。但因样品的个体差异，特征峰的相对含量分布差异较大。在所建立的色谱条件下，各特征峰均达到了基线分离，因此该差异可通过各特征峰的表观丰度(以纵坐标刻度测量)进行表达。
    在整个色谱的全貌中，7～15号峰(主要为二萜内酷类成分)构成了指纹的主要特征，1一6号峰虽然对指纹图谱的贡献相对较小，但在不同样品间均稳定存在，构成了指纹的次要特征。穿心莲所含的主要化学成分及药效成分相一致，因此，确定以内酯类成分为主的巧个特征峰作为穿心莲药材HPLC特征指纹图谱是合理的。
3.3 穿心莲HPLC指纹图谱比较及评价
3.3.1 规范化种植与商品药材指纹图谱比较5个规范化种植基地(广州、河源、清远、饶平及湛江)产穿心莲药材指纹特征相互间较为吻合，然而由于样品的个体差异，特征峰的相对含量分布存在差异，但整体的轮廓均符合共有特征，均可识别为穿心莲。结果表明，实行规范化的种植，对于保证药材质量的稳定性具有重要的意义。
    采用计算机辅助的相似度评价软件进行相似度评价。5个种植基地药材指纹图谱，中位数相关系数在0.9533～0.9900之间;均值相关系数在0.9021～0.995 1之间;中位数相合系数在0.910 3 0.992 2之间;均值相合系数在0.871 7～0.9945之间，相互间吻合程度较高。
3批商品药材(分别购自北京、南宁及广州)指纹图谱与规范化种植药材比较，其中两个批次(北京及广州)色谱概貌差别较大。
    计算机辅助相似度评价，上述商品药材与规范化种植药材共建共有模式，3批次商品药材中位数相关系数分别为:北京0.6298，南宁0.808 1，广州0.950 1;均值相关系数分别为:北京0.5898，南宁0.7256，广州0.902 1;中位数相合系数分别为:北京0.6260，南宁0.8386，广州0.949 8;均值相合系数分别为:北京0.6075，南宁0.7172，广州0.9710，根据相似度判断结果，可识别为不合格药材。
3.3.2 不同生长期药材指纹图谱比较不同生长期穿心莲(采自广州穿心莲规范化种植基地)指纹图谱较为吻合。详细比较每个特征峰在不同生长期的表观丰度，可以发现，特征峰的表观丰度(即成分的含量)大多数随生长期而增高，至采收期(8月下旬至9月中旬)达到最高，采收期后则明显降低，少数特征峰未显示上述特点。
    采用计算机辅助的相似度评价不同生长期药材共建共有模式，中位数相关系数在0.963 5 - 0.996 2之间;均值相关系数在0.970 8 - 0.993 3之间;中位数相合系数在0.965 8-0.9968之间;均值相合系数在0.9572一0.9940之间，相互间吻合程度较高。表明虽然不同生长期样品中成分含量有差异，但其色谱概貌一致，仍可鉴别为穿心莲。
3.3.3 穿心莲叶、茎指纹图谱比较比较广州GAF〕基地不同生长期穿心莲茎及叶色谱分离图谱,4个批次茎的分离图谱基本一致，4个批次叶的分离图谱也较为相似，但特征峰的表观丰度则茎中大大低于叶。由于穿心莲的主要药效成分为二菇内酯类成分，结果表明该成分在叶中含量大大高于茎，而在整个植株中，成熟药材的叶与茎的重量比约为3:7,即在穿心莲药材中，茎的相对比例越高，药材成分的含量越低，也即药材质量越差。
4 讨论
    穿心莲药材质量控制方法为测定穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯的含量，两者的总量不得少于0.8%11，依据该标准，本研究中收集的两批(收集地分别为北京及南宁)穿心莲商品药材(含量分别为0.93%及0.87%)均为合格品。然而，从两者的HPLC指纹图谱，可看出与其他批次样品图谱差异极大，经过计算机辅助的相似度评价，结果也表明两者与共有模式不相吻合，不能判别为穿心莲。
    二萜内酯类成分为穿心莲的主要药效成分，该部位成分群体的一致性(包括成分种类及相对含量的一致性)才能保证该药的生物等效性及保证药效的稳定，而指纹图谱的优势恰恰就在于可对组份群体特征的一致性作出判断。
    中国药典收载穿心莲药材为其干燥地上部分，文献〔5～6〕报道穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯的含量均以叶中为高，本研究的结果也明显地表明，该类成分在叶中的分布高于茎。在整个植株中，成熟药材的叶与茎的重量比约为3:7，即茎的相对比例越高，药材成分的含量越低，药材质量越差。由于成熟的干燥药材在存储运输等过程中，叶极易脱落，造成商品药材质量不稳定及下降的原因之一。因此，建议穿心莲的药用部位改为叶或制定干燥的茎叶重量比