黄芪药材HPLC指纹图谱研究

摘要:目的:对不同来源的黄芪药材指纹图谱进行比较研究。方法:应用HPLC法、ODS柱、乙腈-水二元梯度洗脱,流速为1.0mL/min ,检测波长203nm。结果:不同来源的黄芪药材所含黄芪甲苷等成分均得到很好的分离。结论:该法可用于鉴别黄芪的品种。
黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astraglus m em branaceus( Fisch)Bge. var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪As2
tragalus m em branaceus (Fisch.) Bge.的干燥根。春、秋二季采挖,除去须根及根头,晒干。具补气固表,利尿托毒,排浓,敛疮生肌的作用。临床用于气虚乏力,食少便溏,中气下陷,久泻脱肛,便血崩漏,表虚自汗,气虚水肿,痈疽难溃,久溃不敛,血虚痿黄,内热消渴;慢性肾炎蛋白尿,糖尿病等症。传统的质量控制指标一般是测定其黄芪甲苷的含量,难以反映药材的内在质量。色谱指纹图谱可以较为全面地检测其多种成分在药材中分布的全貌,使药材的内在质量情况可视。本文采用高效液相色谱(HPLC)法,按照中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行),对不同产地的黄芪进行了指纹图谱研究,作为评价和控制黄芪药材内在质量的标准。
1　仪器与试剂
仪器和设备:美国Agilent 1100型高效液相色谱仪,包括:四元梯度泵、真空在线脱气机、柱温箱、二极管阵列检测器、自动进样器、化学工作站;超声波清洗器: CQ20 (广州经济技术开发区明珠电器有限公司) ;电子分析天平: Precisa57871 (全华科学仪器有限公司) 。
黄芪甲苷对照品(批号078129807中国药品生物制品检定所) ,乙腈(色谱纯) ,纯化水(本制剂室自制) ;其余试剂均为分析纯。
药材:黄芪均购自广州市药材公司,经广东药学院罗集鹏教授鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astraglus m em branaceus( Fisch) Bge. var. mongholicus (Bge. ) Hsiao的干燥根。
2　试验方法
2. 1　色谱条件　色谱柱: Hypersil ODS (4mm×250mm 5μm)色谱柱(Agilent 1100);流动相:乙腈-水(30∶70)二元梯度洗脱;流速1mL/min;检测波长203nm;柱温:30℃;分析时间:60min;进样量:20μL。
2. 2　供试品溶液的制备　称取各黄芪药材30.00g,剪碎,置具塞椎形瓶中,加甲醇140mL,浸泡过夜后,超声提取10min,将溶液过滤,回收甲醇至干,残渣加水10mL溶解后,转移至分液漏斗中,以水饱和的正丁醇萃取3次,每次20 mL,合并正丁醇萃取液,将正丁醇减压回收至干,用甲醇溶解并定容至5.0mL量瓶中,制得样品溶液。
2. 3　对照品溶液的制备　精密称取黄芪对照品适量,置10mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,制成含黄芪1 mg/mL的溶液,作为对照品溶液。
2. 4　流动相的选择　试验过程中,系统比较了不同浓度的甲醇-水(70∶30,55∶45,45∶55)、乙腈-水(70∶30, 50∶50,30∶70)等不同体系的二元梯度洗脱系统。试验结果表明,以乙腈-水(30∶70)二元梯度分离度最好,特征峰明显,样品90min图谱显示, 60min样品峰即可分离完全、无继续特征峰出现,因此,本文选取乙腈-水(30∶70)二元梯度洗脱体系为流动相,分析时间为60min。
2. 5　检测波长的选择　吸取上述样品溶液20μL进样,以乙腈-水(30∶70)二元梯度洗脱体系为流动相,利用DAD检测器进行全波段扫描检测分析,结果表明,该样品在203nm处有比较显著的特征色谱峰,因此,本文选取203 nm作为检测波长。
2. 6　参照物的选择　通过对不同产地及相同产地不同批号黄芪药材HPLC色谱图系统考察,所有药材中s号峰的含量较高,且较为稳定,因此,选取s号峰作为参照物。
2. 7　测定方法　分别精密量取对照品溶液和各样品溶液20μL,注入液相色谱仪,记录60min色谱图即得。以黄芪甲苷的色谱峰(s)的保留时间和峰面积为1,计算其它各峰的相对保留时间和相对峰面积的比值。
3　方法学考察
3. 1　线性关系　分别精密吸取贮备液100, 200, 400, 600,1100, 2000μL,置1mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,取以上溶液各20μL, 注入液相色谱仪,按上述条件进行测定,各浓度分别测定2次,以进样量(μg)的常用对数值为横坐标,以对照品峰面积的常用对数值为纵坐标,绘制标准曲线。求得回归方程为: Y=1.0623X + 1.633, r=0.9994,进样量在2.061～41.663μg内呈良好的线性关系。
3. 2　黄芪甲苷含量的测定　分别精密量取各样品溶液20μL,注入液相色谱仪,按上述方法进行测定,将测出的各样品溶液峰面积的常用对数值代入回归方程,计算出各样品溶液的黄芪甲苷含量。
3. 3　精密度试验　取对照品溶液,连续重复进样5次,每次进样20μL,按上述条件进行测定,黄芪甲苷峰面积的RSD为2.44。
3. 4　稳定性试验　以内蒙古呼和浩特产黄芪药材为供试品,分别在0,2,8,12,24h进样,按上述条件进行测定,结果表明,各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化。说明本方法稳定。
3. 5　重现性试验　取内蒙古呼和浩特产黄芪药材5份为供试品,按样品溶液制备方法处理,按上述条件进行测定,结果表明,各色谱峰的相对保留时间和单峰面积大于或等于10的峰(1,5,6,s号峰)面积比基本一致。
3. 6　样品测定　按样品溶液的制备方法操作,分别取各批药材制成样品溶液,取20μL进样。同前条件测定图谱,结果表明:5个不同产地的黄芪药材有13个共有峰,其HPLC指纹图谱基本一致,共有峰面积之和均大于各总峰面积的90,但其共有峰面积的比值有一定差异。
4　讨论
本试验曾用10.0g药材, 50mL甲醇浸泡1h,索氏提取器回流提取,但由于样品量少,提取时间长,测出结果不理想;后改用30.0g药材, 140mL甲醇浸泡过夜,超声提取法提取,大大提高了样品的浓度,使各峰分离效果好。
本试验曾试图采用高效液相色谱仪2蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法测定不同产地黄芪的指纹图谱,但测出黄芪各峰的分离度不好,干扰成分多;后改用紫外检测器(HPLC)进行测定,才达到较理想效果。
试验结果表明,5个不同产地黄芪药材指纹图谱中主要峰群的整体图貌基本一致。但各成分峰面积的相对比值有所不同,为快速鉴别区分不同来源的药材提供了科学的依据。
本文采用HPLC色谱法,建立了黄芪药材的指纹图谱分析方法。结果表明:方法稳定、可靠、重现性好。