女贞子药材HPLC指纹图谱的初步研究

摘要:目的:建立女贞子中药材的HPLC指纹图谱分析方法。方法采用HPLC-ELSD法,色谱柱:Lichrospher C18柱(4.6mm×250mm, 5μm);Alltech ELSD2000型蒸发光散射检测器;流动相:甲醇- 水( 梯度洗脱)。以齐墩果酸为参照物分析了16批不同产地的女贞子样品, 采用计算机辅助相似性评价系统进行评价。结果女贞子中药材HPLC 指纹图谱由14个特征峰构成指纹图谱的特征,10批样品的指纹图谱的相似度均大于0.90,符合指纹图谱研究技术的要求,所建立的指纹图谱具有稳定、重现的特点。结论该方法准确、简单,其色谱指纹图谱可用于女贞子中药材的鉴别和质量控制。
关键词:女贞子;指纹图谱;HPLC-ELSD
女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实, 全国产区较多。女贞子含女贞子苷、洋橄榄苦苷、齐墩果酸、乙酰齐墩果酸、熊果酸、乙酰熊果酸、4- 羟基- β-苯乙基-β-D-葡萄糖苷、桦木醇、甘露醇、棕榈酸、脂肪酸、苹果酸等成分,其中三萜类成分齐墩果酸与熊果酸、皂苷类成分女贞子苷等在紫外区吸收均较弱,采用紫外检测器分析效果不太理想。本文采用ELSD(蒸发光散射检测器),用反相高效液相色谱法对女贞子指纹图谱进行研究,并进行了方法学考察,获得了满意的结果。
1 仪器与试药
1. 1 仪器Waters Alliance HT 型高效液相色谱仪,Alltech ELSD 2000 型蒸发光散射检测器, SPB- 3 全
自动空气源( 北京中惠普分析技术研究所) 。
1. 2 试药甲醇( 色谱纯, Tedia 公司, 美国),水为超纯水,其他试剂均为分析纯。齐墩果酸与熊果酸对照品( 均由中国药品生物制品检定所提供, 批号分别为110709 - 200304、110742 - 200313) , 16 批试验用女贞子经陕西省药品检验所中药室郝武常主任鉴定均为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 色谱柱: Lichrospher C18 柱( 4.6mm×250 mm, 5μm)( 江苏汉邦公司);流动相:甲醇-水线性梯度洗脱;柱温:30℃; ELSD漂移管温度:95℃;雾化气源选用纯净空气源:2.5L/min; 放大系数( Gain): 4; 撞击器( Impactor):off。在此色谱条件下,理论板数以齐墩果酸峰计不低于5000。
2. 2 供试品溶液的制备 取本品粉碎,精密称取1.0g,置50mL具塞锥形瓶中,精密加甲醇25mL,称重,超声处理45 min,取出,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,滤液再用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液。
2. 3 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸与熊果酸对照品适量, 加甲醇制成每1mL分别含0.4mg与0.1mg的混合溶液,摇匀,即得。
2. 4 测定方法 精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定。记录女贞子色谱图2h,由图可见60min后已无色谱峰出现,因此将60min 以前的色谱图作为女贞子指纹图谱。以供试品溶液中齐墩果酸为参照峰(S)分别计算各峰的相对保留时间和相对峰面积的比值,采用国家药典委员会相似度对比软件2004A版进行相似度计算。
2. 5 精密度试验 取11号样品细粉, 按供试品溶液制备方法制得供试品溶液,连续进样5次,记录指纹图谱。结果表明,各共有色谱峰的相对保留时间的RSD(%) 在0.42～2.55之间,相对峰面积的RSD(%) 为0.31～2.34,符合指纹图谱研究技术的要求;以第3张图作为参照谱图, 采用中位数法产生对照指纹图谱,计算相似度,结果各指纹图谱的相似度均大于0.90,符合指纹图谱研究技术的要求。
2. 6 稳定性试验 取11号样品细粉,按供试品溶液制备方法制得供试品溶液,分别在0,6,12,18,24h进样,记录指纹图谱。结果各共有色谱峰的相对保留时间的RSD(%) 在0.25 ～1.87之间,相对峰面积的RSD(%)为0.30～2. 17,符合指纹图谱要求;以第3张图作为参照谱图,采用中位数法产生对照指纹图谱,计算相似度,结果各指纹图谱的相似度均大于0.90,符合指纹图谱研究技术的要求。说明供试品溶液在24h内稳定性良好。
2. 7 重复性试验 取11号样品细粉5份,按供试品溶液制备方法制得供试品溶液,分别进样,记录指纹图谱。结果表明,各共有色谱峰的相对保留时间的RSD(%) 在0.27～1.95之间,相对峰面积的RSD(%)为0.23～1.99,符合指纹图谱研究技术的要求;以第3份样品图作为参照谱图,采用中位数法产生对照指纹图谱,计算相似度,结果各指纹图谱的相似度均大于0.90,符合指纹图谱研究技术的要求。
2. 8 样品测定 取16批女贞子进行测定, 共获得14个共有色谱峰(其中10号峰为S峰)。典型色谱图。各共有色谱峰相对保留时间,基本符合指纹图谱研究的技术要求,但各共有峰的相对峰面积RSD值却较大,主要反映了各地产区的女贞子药材中各共有成分的含量比例差异较大。配合生药学鉴定结果,并参考中国药品生物制品检定所的标准药材,从以上16批药材中选取10 批各组分含量相对较高质量较优的药材( No.1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11,14, 15),采用国家药典委员会的相似度比较软件(2004A版),以No.14号样品图作为参照谱图。采用中位数法产生对照指纹图谱,计算相似度,结果各指纹图谱的相似度均大于0.90,符合指纹图谱研究技术的要求。
3 讨论
3. 1 提取溶剂与提取方法的选择采用乙醇、乙醚、无水乙醇、甲醇、50 %甲醇、氯仿、丙酮等多种溶剂进行索氏提取, 以甲醇提取液出峰数较多且活性成分齐墩果酸得率略高,故选择甲醇作提取溶剂。用甲醇作溶剂,对比索氏提取与超声处理两种提取方法,结果二法所得峰数与各峰面积未见明显差异,为便于操作,选择超声处理作为供试品处理方法。
3. 2 色谱柱的选择试验中,选用了不同类型的色谱柱:( 1) GL Sciences Inc.公司Inertsil ODS-3(4.6×250 mm, 5 μm);( 2) 江苏汉邦科技LichrospherC18 (4.6 ×250mm, 5μm);( 3) SHMADZU 公司VP-ODS ( 4.6×250mm) ; (4) Phenomenex 公司Luna C18 (4.6×250mm, 5μm);( 5)Waters 公司SymmetryShield RP18 (3.9×150mm, 5μm)。以上色谱柱, 江苏汉邦科技Lichrospher C18 对女贞子中齐墩果酸( 主要活性成分)与熊果酸的分离效果最好,加之价格较低,通用性强,故选用。
3. 3 流动相的选择 试验过程中对比了不同的流动相:甲醇-水、甲醇- 乙腈-水、乙腈-水、乙腈-0.5 %醋酸铵溶液、甲醇-0.5%醋酸铵溶液等多种流动相体系, 其中以甲醇-水进行线性梯度洗脱即能使各成分得到较好的分离, 故选用。
3. 4 检测方法的选择 蒸发光散射检测器是一种通用型质量检测器,响应不依赖于样品的光学特性,能分析任何挥发性低于流动相的化合物,并且能在多溶剂梯度的情况下获得稳定的基线,使得分辨率更好、分离速度更快, 所以,对含较多紫外末端吸收和紫外吸收较弱成分的女贞子药材进行HPLC指纹分析,并采用蒸发光散射检测器行进检测。