色谱指纹图谱指数F和相对指数Fr的研究

                                          孙国祥*，刘晓玲, 邓湘昱，孙毓庆，毕开顺
                                       （ 沈阳药科大学药学院 辽宁 沈阳 110016 ）
      摘要：目的 提出色谱指纹图谱指数（F）和相对指数（Fr）概念，用F和Fr揭示中药色谱指纹图谱信息的丰富程度和分离情况，反映指纹信号强度的大小和均化程度。方法 用HPLC和HPCE指纹图谱实验结果进行应用研究。结果 评价了射干抗病毒注射液及其各单味药材的指纹图谱结果，并对文献中丹参HPLC指纹图谱进行了评价。当评价中药毛细管电泳指纹图谱时，其F无显著差别，但Fr是HPLC法的1000倍之上。结论 F与Fr可客观、全面、简捷地用于评价色谱指纹图谱。
     关键词：色谱指纹图谱指数；色谱指纹图谱相对指数；射干抗病毒注射液
     中图分类号：R927.11；R927.5 文献标识码：文章编号：
                      Study on the Index F and Relative Index Fr of Chromatographic Fingerprints
                       SUN Guo-xiang，LIU Xiao-ling，DENG Xiang-yu，SUN Yu-qing，BI Kai-shun
             （College of pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China）
    ABSTRACT: AIM The Index F and relative Index Fr of Chromatographic Fingerprints were firstly proposed to indicate how bountiful was the information in chinese traditional medicines chromatographic fingerprints，how better was the separation effect，how high was the peak signal and how equal were the peak areas. METHODS The Index F and relative Index Fr of chromatographic fingerprints were firstly applied to evaluate the chromatographic fingerprints results of chinese traditional medicines determined by the reversed-phase High Performance Liquid Chromatographic method and High Performance Capillary Electrophoresis. RESULTS The Shegan Kangbingdu Injection and all its chinese traditional medicines ingredients had been evaluated by F and Fr, so did for the HPLC fingerprints of Radix Salviae miltiorrhizae reported in literature. As the same time, the F and Fr of the capillary electrophoresis fingerprints of Folium isatidis,Rhizoma belamcandae and Compound liquoric tablets were successfully determined. As far as F was concerned, there was no evident difference between HPLC and capillary electrophoresis, but the Fr values came from CE was usually a thousand times more than that from HPLC. CONCLUSIONS The F and Fr can be applied to evaluate objectively, simply and thoroughly the chromatographic fingerprints.
KEY WORDS：The index of chromatographic fingerprints F；The relative index of chromatographic fingerprints Fr；Shegan Kangbingdu Injection
      基金项目：本文为国家药典委员会注射剂指纹图谱项目
      通讯作者：Tel: 13940272571, Email:gxswmwys@163.com
      中药指纹图谱研究是促进中药现代化的必要手段，其目的是全面、客观、真实地控制中药质量。我国从2005年起对中药注射剂将全面实施指纹图谱（FP）控制技术，可以预见在不远的未来，所有中药制剂也必然采用FP技术进行标准化控制，进而实现中药的安全、有效、稳定和可控这一现代化目标，所以FP技术对我国中药制药工业的发展具有重要的战略意义。因FP的评价方法目前还较少，本文提出用色谱指纹图谱指数（F）优化选择指纹图谱条件，以F和指纹图谱相对指数（Fr）反映取样量、信号强度、信号均化性、指纹信息量、分离效果和效率等多方面信息，试图用F和Fr来评价色谱指纹图谱，为制订理想的色谱指纹图谱提供理论方面的参考。
射干抗病毒注射液（SGKBDI）[1]由射干、金银花、佩兰、茵陈、柴胡、蒲公英等八味药组方，经现代工艺精制而成，是疗效显著的抗病毒及抗菌消炎药。用于上呼吸道感染，流行性腮腺炎、带状疱疹和急性病毒性肝炎等疾病，以及治疗流行性出血热早期病症。该制剂是国家中药注射剂FP研究项目之一，本文以F和Fr为指标评价了SGKBDI各单味药材、制剂FP以及CE指纹图谱的分离情况。
      1 基本原理
      1.1 有效分离率（ ） 若色谱法获得n个峰，基线分离的峰对数为m （R≥1.5），则有效分离率为： … （1） ， n-1为总峰对数，显然m=n-1时， ，所有峰都达到基线分离（最理想情况），因此β值代表分离的效果。
      1.2指纹信号响应强度（R） 将n个峰作谷—谷积分，则总分离信号大小的乘积 …（2），Ai为第i个峰的面积，A0为系统指纹峰的几何平均峰面积，R代表指纹信号响应总强度，其值越大越好。
      1.3 指纹信号均化系数（γ） 指纹信号分布的均匀性直接影响判别化学成分分布的有效性，在不考虑各成分药理活性大小的前提下，以各化学成分等信号强度分布最为理想。通过计算向量 =(1,1,1,…,1) 和指纹向量 = (A1,A2,A3,…,An) 之间的夹角余弦值，即求出 与 相似度系数[2]γ，以γ表征指纹信号均化程度：
…（3）为指纹峰的平均峰面积，γ越接近1，则信号平均化越好。
     1.4 色谱指纹图谱指数（F） 在同时考虑指纹信号均化系数γ和有效分离率 时，FP信号强度 …（4），则定义 …（5）。F是代表指纹信号大小、信号均匀化程度和分离效率高低的指数，因此称之为色谱指纹图谱指数，它直接反映获得基线分离的指纹峰数的多少和信号的大小。根据中药成分的复杂性，假设获得理想FP的合理时间为50 min，在给定条件下，完成分离所用时间为t，t越小越好，代表时间效率越高。FP赖以产生的物质基础是从中药中提取的化学成分，样品制备时使用的原生药量以及样品的稀释倍数，进样量的大小都应该列为FP的有效优化条件，因此考察由1mg中药材（或制剂）提取物进样后获得的F值，有助于了解样品提取信息的丰富程度和中药中化学成分分布浓度的大小。综合指纹信号强度、信号分布的均匀性、分离效率（有效分离率和时间效率）以及原生药材（或制剂）的取量等多方面信息，则得到色谱指纹图谱相对指数Fr：（6）n指纹峰总数、γ信号均化系数、β有效分离率、Ai以谷—谷积分获得的峰面积、A0是n个指纹峰的几何平均峰面积、Q与一次进样量相当的原生药材（或制剂）质量（mg），t最后一个指纹峰出完峰的时间（min）。Fr是将1mg药材（或制剂）提取物进样后，在50分钟内经色谱柱分离后产生基线分离的、信号均化的指纹信号的大小，较大的Fr代表FP条件越理想。若100个指纹峰在50 min内完全分离，m =100-1, β=1, 指纹信号均化系数γ=1，进样量相当于原生药1 mg（即Q=1mg），则Fr=100lgA0 若A0=102～108，因此Fr不大于1000，很容易证明HPLC的F和Fr通常都低于1000，但CE法由于进样量是HPLC的1‰以下，因此CE法的Fr是HPLC的1000倍之上。
     2 实验部分
     2.1仪器与试剂
     Agilent 1100 型液相色谱仪（配有二极管阵列检测器、四元梯度泵、在线脱气装置、自动进样器），ChemStation工作站（Agilent科技有限公司）。射干、金银花、佩兰、茵陈、柴胡、蒲公英、板蓝根、大青叶购于各产地（经笔者鉴定），射干抗病毒注射液（市售品）。甲醇、乙腈、异丙醇（色谱纯，山东禹王实业总公司），其它试剂均为分析纯，所用水为去离子水。
     2.2色谱条件
     色谱柱：Kromasil ODS ( 25 cm×4.6 mm，5 μm )。流动相：分别采用甲醇、乙腈、异丙醇和水不同比例的梯度洗脱。流速1.0 mL·min-1，柱温25 ℃，进样量5μl，紫外检测波长254 nm～326 nm（DAD检测）。
     2.3 样品供试液的制备
     2.3.1药材供试品溶液 取不同产地药材适量，60℃干燥20 min，精密称取混合均匀的药材适量，以水为提取溶剂按制剂工艺制备各药材的供试品溶液，HPLC分析前用0.45μm滤膜过滤。
     2.3.2注射液供试品溶液 精密量取射干抗病毒注射液2.0 mL，用水稀释至10 mL，摇匀，进样前用0.45μm滤膜滤过。
     2.4 用F和Fr评价指纹图谱
     我们根据目前已经完成的试验结果，计算了各单味药和SGKBDI的F和Fr见表1。因指纹峰数较少和A0较小导致板蓝根的F值最小，但分析时间最短（22.9 min）和信号的均化性良好（γ=0.6079）又使其相对指数较大（Fr=104.5），说明F反映的是系统分离情况，而Fr更侧重于反映时间效率和单位质量样品的信息量。在254 nm测定大青叶的F=73.5较大，但由于分析时间长（72.4 min）和1次进样相当的原生药质量大使其Fr（50.6）偏小。在265 nm测定佩兰的指纹峰数是很多的，但由于指纹峰的信号均化性较（γ=0.3536）使其F=46.1。注射剂的Fr与药材的相差很大，这说明在制剂中药材各化学成分不是完全出现的，有些成分由于工艺原因可能缺失或转移进制剂中不完全。试验时我们发现一个完全按部颁标准生产的厂家的F和Fr分别是另外一个厂家的1.6～1.9倍，说明后者没有按部颁标准工艺生产，或对制剂进行了稀释（因制剂仅控制绿原酸含量≥0.5mg·mL-1，其F和Fr产生显著差异的主要原因是峰面积相差太大）。
Table 1 The F and Fr data of SGKBDI and their components
No Name λ n m γ F t/min Q/mg Fr
1 Rhizoma Belamcandae 265 69 51 97.0
0.302 31.1 78.5 0.50 39.5
2 Flos Lonicerae 254 48 34 222.7 0.414 33.8 58.6 0.50 57.5
3 Herba Eupatorii 265 70 57 178.8 0.354 46.1 72 0.50 63.9
4 Herba Artemisiae scopariae 326 29 24 48.2 0.518 21.7 62.4 0.50 34.7
5 Radix Bupleuri 265 49 41 59.7 0.678 50.4 68.8 1.00 36.5
6 Herba Taraxaci 254 51 43 79.4 0.394 32.8 67 0.50 48.9
7 Herba Taraxaci 265 54 46 72.1 0.463 40.3 67 0.50 60.1
8 Radix Isatidis 254 33 21 66.6 0.608 24.0 22.9 0.50 104.5
9 Folium Isatidis 254 70 62 75.2 0.623 73.5 72.4 1.0 50.6
10 Folium Isatidis 265 63 52 121.4 0.584 64.3 67.5 1.0 47.5
11 SGKBDI 254 50 46 84.1 0.553 50.0 67.2 2.5 14.9
12 SGKBDI 265 47 46 78.3 0.528 47.0 68.5 2.5 13.7
13 SGKBDI 326 21 20 102.7 0.602 25.4 68.5 2.5 7.4
14 Radix Salviae Miltiorrhizae 254 12 10 13652.4 0.668 30.1 67.2 0.064 350.3
15c Rhizoma Belamcandae 228 21 16 4.17×106 0.533 59.3 31.5 0.0010 9.41×104
16c Folium Isatidis 228 37 35 38933.4 0.708 116.9 57 0.0010 1.03×105
17c Compound liquorice tablets 228 20 18 1.06×106 0.558 63.7 28.8 0.0010 1.11×105
c refer to CEFP.
      2.3 用F和Fr选择试验条件
      试验条件的确立应尽量使F（或Fr）有较大值，蒲公英在265 nm的F=40.3（Fr = 60.1）大于其在254 nm的F=32.8（Fr = 48.9），且指纹峰数多，所以，测定波长首选265 nm。同样，测定大青叶FP应选择254 nm。在确定SGKBDI的测定波长时，虽然在254 nm的F=50.0大于在265 nm的F=47.0，但由于二者完全分离的指纹峰对数都是46，后者β=1全部基线分离，因此选择265nm，这对控制注射剂的质量几乎不会产生影响。板兰根、大青叶和SGKBDI的FP见Fig.1（A）、（B）、（C）、（D）和（E）。从Fig.1和Tab.1中可以看到指纹峰越多、分离越好，F越大；样品取量越少、分析时间越快，则Fr越大。
为验证方法的可靠性，引用文献数据[3]计算丹参的F和Fr分别是30.1和350.3。从F与指纹峰数的关系来看，丹参的F应在20左右，其Fr=350.3更显得特别大，因为采用紫外检测器测定指纹峰的面积明显大，即灵敏度高使样品浓度很低时就能检测到很大的信号。我们用二个不同厂家生产的毛细管电泳仪测定了射干、大青叶和复方甘草片的毛细管电泳指纹图谱（见Fig.2），测得其F都很大，主要因为峰面积大产生（但数值并未离群），其Fr特别大是因为CE的进样量极低（为HPLC的10-3以下）和分析效率极高（分析时间短）导致的。以同一台仪器在相同灵敏度条件下，使用F和Fr的可比性是较好的；不同的仪器、不同的灵敏度（包括记录数据工作站的灵敏度）应适当考虑相同信号的等同性校正，否则可比性就不会特别好。
      2.4结论
      色谱指纹图谱指数F具有：a）能够揭示中药指纹图谱信息的丰富程度和分离情况，b）能够反映指纹信号强度的大小，c）能够反映信号的均化程度，以上三个因素协同作用的结果可得到很高的F值。色谱指纹图谱相对指数Fr由于考虑了时间效率和一次进样相当的原生药材质量，侧重于反映样品提取的信息量、仪器灵敏度和分析方法的效率，CE法的Fr是HPLC法的1000倍之上就是充分的例证。中药FP的建立不但要获得尽可能多的色谱峰，全面反映药材或制剂的质量，而且必须考虑样品提取方面的定量信息（明确取样量、固定提取方法和供试液的浓度），这是目前我国在FP研究方面容易忽视的地方。本文提出了色谱指纹图谱指数和相对指数，试图应用于评价FP的优劣，F和Fr的计算并不麻烦，其应用的效果也较为理想。由于我国是中药的发源地，在FP研究方面具有极大的优势和广阔的应用前景，能够适时地找到对FP研究工作有益的方法或能够给FP研究工作者提供有益的参考是本文的研究目标。因刚刚提出色谱指纹图谱指数，其有待更多的实践检验。


参考文献：
[1] The Pharmacopoeia Commission of the People’s Republic of China. Drug Specifications Promulgated by the Ministry of Public Health, PR China (Prescriptions of Traditional Chinese Drugs),1999,vol.20: 265-266
[2] Wang LX，Xiao HB，Liang XM, et al. Vectorial angle method for evaluating the similarity between two chromatographic fingerprints of chinese Herb[J]. ACTA Pharm Sin（药学学报），2002，37（9）：713-717.
[3] Zhang WS，Ye ZL，Yue HB，et al.Fingerprints of Radix Salviae Miltiorrhizae[J]. Journal of Chinese Medical Materials(中药材)，2001，24（7）：478-480.
[4] Sun GX, YU W, Sun YQ，et al. The quality assessment of compound liquorice tablets by capillary electrophoresis fingerprints[J]. Analytical Science（Japan）, 2003, 19（10）：1395-1399.






Fig. 1 The HPLC fingerprints of （A）Radix Isatidis，（B）Folium Isatidis，（C）SGKBDI（254 nm）、（D）SGKBDI（265 nm）and（E）SGKBDI（326 nm）


t/min
Fig.2 The standard CEFP of Rhizoma Belamcandae
1.Irisflorentin，9.Iridin，16. Irigenin，reference peak （wavelength 228 nm）