关键词：高效液相色谱法；山楂果实；活性物质
山楂提取物具有抗氧化、清除自由基等作用。多数学者认为，黄酮和低聚前花青素是山楂提取物的两类主要活性物质。用高效液相色谱法(HPLC)对其进行分析的报道较多，但是到目前为止尚未见到能同时分析这些成分的令人满意的方法。本文建立了一种能同时分析山楂果实中这些活性成分的HPLC方法。
1 实验部分
1．1 试验材料
表儿茶素、绿原酸，购于Sigma公司；前花青素B2、金丝桃苷、Isoquercitrin，购于日本Funakoshi试剂公司；前花青素B5、C1，以山楂果为原料经Sephadex LH20柱分离、制备型HPLC精制。其余试剂为分析纯。
1．2 样品处理方法
取山楂果去籽切碎混匀，称取2g放入研钵中，加甲醇2mL、50％ 磷酸水溶液100μL，研磨后用甲醇转移到25mL容量瓶中定容，用超声波振荡提取l0min，取1mL于4000r/min转速下离心5min，上清液过0.45μm 滤膜备用。
1．3 色谱分析条件
高效液相色谱系统由两台P200Ⅱ高压恒流泵、UV200Ⅱ紫外．可变波长检测器以及Echrom98色谱工作站等(大连依利特分析仪器有限公司)组成。色谱柱为HYPERSIL BDS分析柱(200mm×4.6 mmi．d．，5μm)。流动相A：20％(体积分数)甲醇水溶液(pH 3.2O)，流动相B：30％ (体积分数)乙腈水溶液(pH 3.2O)，得线性梯度洗脱程序；流速0.6mL／min；检测波长280nm；进样量1OμL；以外标法定量。
2 结果与讨论
2．1 色谱条件的确定
山楂果实中活性物质大多为多酚类成分，这些成分的极性差异很大，很难在等度洗脱条件下同时分离。在乙腈-水体系中弱极性的黄酮类成分保留时间较长，分离效果较好；而甲醇-水体系对低聚前花青素类极性成分的洗脱能力较强，适于样品中极性成分的分离。在酸性体系下酚酸成分分离较好，其他酚类成分也需要在酸性条件下进行分离，所以把流动相pH确定为3.1O～3.2O。绿原酸、两种黄酮和前花青素类物质在280nm处都有较强的信号，故确定检测波长为280nm。本文采用酸性的甲醇水溶液和乙腈水溶液在优化的梯度洗脱程序下洗脱，使山楂的主要活性成分在35min内得到了较好的分离。
2．2 方法评价
在梯度条件下，用绿原酸，表儿茶素，前花青素B2、B5、C1，金丝桃苷和Isoquercitrin标准品进行分析，各成分的回归方程(Y：峰面积；X：含量，μg)和相关系数r依次为：Y=1.354 + 29.93，r=0.9998；Y=1.O54X一3.748，r =0.9998；Y=0.673一22.489，r=0.9997；Y=0.538+4.665．r=0.9999；Y=0.700X一6.614，r=0.9998；Y=2.393 + 46.250，r=0.9995；Y=2.855一90.520，r =0.9996。相对标准偏差(n=5)分别为：2.15％，2.21％，4.57％，2.69％，3.06％，1.44％，1.38％。线性范围(μg)分别为：0.O68 9～0.2260，0.0469～0.3350，0.1355～0.3660，0.1250～0.8230，0.1282～0.6510．0.2078～0.9870，0.3275～0.8370。回收率分别为：95.2％，105.8％，103.996，
97.7％，96.2％，93.9％ 和94.O％。方法准确灵敏，定量可靠。
参考文献：
[1] Rigelsky J M，Sweet Burgunda V．American Journal of Health-System Pharmacy，2002，59(5)：417
[2] Cuyckens F，Claeys M．Rapid Commun Mass Spectrom，2002．16(24)：2 341
[3] Svedstrom U，Vuorela H，Kostiainen R，Huovinen K，Lalkoso I．Hiltunen R．J Chromatogr A，2002，968(1—2)：53
[4] Urbanek M，Pospisilova M，Polasek M．Electrophoresis，2002，23(7-8)：l 045
作者：
2006-4-1