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高效毛细管电泳法在尼可地尔及其分解物控制分析中的应用

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摘要:摘要:用高效毛细管电泳法对尼可地尔及其分解物[N-(2-羟乙基)烟酰胺]进行了分离和定量测定研究。3的磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲体系中,尼可地尔与分解物可达基线分离。尼可地尔和分解物浓度分别在12。由于该药,特别是片剂,在贮藏中易分解。...

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 摘要:用高效毛细管电泳法对尼可地尔及其分解物[N-(2-羟乙基)烟酰胺]进行了分离和定量测定研究。以烟酰胺作内标,在电压23kV、波长264±2nm、pH 5.3的磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲体系中,尼可地尔与分解物可达基线分离。尼可地尔和分解物浓度分别在12.0—264.18mg/L和2.10—43.80mg/L范围内与峰面积呈良好的线性关系。
    关键词:高效毛细管电泳,尼可地尔,N-(2-羟乙基)烟酰胺,烟酰胺
    1 引 言
    尼可地尔(nicorandil)化学名为N-(2-羟乙基)烟酰胺硝酸酯,具有烟酰胺和硝酸酯结构特点的化合物,故又名硝烟酯。在临床上用于心绞痛、高血压等疾病的治疗。现临床研究不断取得新成果,扩大了它的应用范围。由于该药,特别是片剂,在贮藏中易分解。分解物N-(2-羟乙基)烟酰胺是合成工艺中间体也是服用该药后的代谢产物。对尼可地尔及分解物进行定量测定,对该药的质量评价和临床应用研究,尤为必要。测定该药的分析方法有高效液相色谱法、示波极谱法等。国内药品质量标准多采用比色法、分光光度法(uv)对其片剂进行测定,但分解物的干扰难以排除。对分解物的测定有高效液相色谱法,用高效毛细管电泳法(HPCE)未见报道。HPCE是一种高效分离技术,具有样品用量少(1—30nL)、分离速度快等特点,广泛应用于化学、生物、医药、环境等领域。另一方面,化学计量学在HPCE中的应用进一步拓宽了HPCE在药物控制分析中的应用 。本实验用HPCE法对尼可地尔及分解物进行分离、定性、定量测定,取得满意的结果。方法准确、灵敏度高,对尼可地尔生产过程质量监控、留样观察、临床药理研究提供了较为理想的方法。
    2 实验部分
    2.1 仪器与试剂
    P/ACE 5500型高效毛细管电泳仪,二级管阵列检测器(美国贝克曼公司);50 cm×75μm i.d.石英毛细管柱(河北永年光导纤维厂);SN-720型pH仪(美国Orion公司);UV-2001紫外.可见光谱仪(日本日立公司)。尼可地尔(NIC)对照品(江苏省帝益药业有限公司),N-(2-羟乙基)烟酰胺(HN)(因未获得纯HN,用含HN的NIC)为陕西省医药工业研究所留样药品;NIC片:20011101、2000401、990301、980901(陕西省正康医药化工公司);880905(陕西省医药工业研究所),其它试剂均为分析纯,溶剂为二次去离子蒸馏水。所用试液均用4.2μm的滤膜滤过。
    2.2 缓冲液和样品溶液的配制
    分别配制25mmol/L磷酸二氢钾、25mmol/L磷酸氢二钠储备液,各取适量混匀,用储备液调节,制得pH 5.3的磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液。配制NIC 600mg/L和HN 100mg/L,作为对照品储备液,其它不同浓度的标准液经稀释得到;内标物烟酰胺(NA)600 mg/L。上述样品用缓冲液溶解并稀释到刻度,摇匀、滤过,待用。
    2.3 实验方法
    毛细管在使用前依次用0.1mol/L NaOH、蒸馏水、0.1mol/L HCI、蒸馏水、缓冲液冲洗约5min,以保证毛细管电泳图的重现。压力进样,时间6s。分离电压23kV,毛细管工作温度:22±10C,测定波长:264±2nm。数据采集与分析用美国贝克曼公司随机所带软件进行处理。
    3 结果与讨论
    3.1 缓冲溶液离子浓度及电压对毛细管电泳分离的影响
    在毛细管电泳中,缓冲溶液组分、离子浓度、电压等对电渗流(EOF)速度、样品的分离影响较大。本实验分别选用硼砂、柠檬酸、碳酸钠及磷酸盐等多种试剂配成不同组分、不同浓度的缓冲液,调节电压15~25kV,分离样品。从峰型好、峰高随样品浓度变化灵敏、样品分析周期短等方面考虑,选用25mmol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲体系、分离电压23kV。
    3.2 pH值对毛细管电泳分离的影响
    背景电解质pH可以改变熔硅毛细管表面特性,对EOF产生影响。pH高,毛细管表面负电荷密度大,EOF速度快。反之,EOF速度慢。pH不仅影响EOF亦影响样品的电泳行为。HN和NIC是两性化合物,以pH 4.8~8.0的25mmol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钠为运行缓冲液,均能达到基线分离。从图看出:pH高时,噪音、背景吸收较大,两峰迁移时间差小;pH为5.3~5.6,背景吸收小,峰型尖锐;pH在此范围内样品的峰高、峰面积随浓度变化灵敏;pH 4.8时,NIC拖尾明显,迁移时间长。故实验选用pH 5.3的缓冲液。在上述选定条件下,用NA作内标,迁移时间位于HN与NIC之间,对分离不干扰。
    NA价格低廉,易得。
    HN、NA和NIC 3种物质同一个母体,仅是酰胺基N 上的取代R不同:R====H(NA):R====CH2CH2OH(HN); R====CH CH2CH2ONO2(NIC)。吡啶环上的氮原子,在酸性环境中接受质子的能力较强,成为荷正电粒子。这3种物质由于荷电能力,粒子大小不一,在电场中迁移速度不同,而获得分离。
    3.3 线性范围、溶液稳定性和迁移时间重现性
    用NIC和含HN的NIC储备液配置成系列浓度,以本法测定,对照品溶液浓度Y与峰面积比值F呈良好的线性关系,NIC和HN的回归方程分别为:Y=6.614992F一0.057068,r=0.99949, RSD=2.930%,n=6;Y=38.2605F一0.016657,r=0.99972.RSD=2.552%,n=6。线性范围分别为:NIC:12.0~264.18 mg/L;HN:2.10~43.80 mg/L
    3·3·1 对溶液稳定性考察 NIC对照品溶液间隔24h,48h测定未见HN峰。48h后对照品浓度大于200mg/L时可见HN峰。
    3·3·2 对NIC和HN峰的迁移时间重现性考察 NIC峰18次测定,平均迁移时间5.27min,RSD=3.669%。HN 19次测定,平均迁移时间2.98min,RSD=1.9%
    3.4 回收率及相对标准偏差
    因缺少HN纯品,用含HN的NIC药品作对照品。该药电泳图仅有NIC和HN两个峰,用峰面积归一法确定HN和NIC的含量。测定6次,平均峰面积:HN 14.24% 、NIC 85.76% ,RSD=0.028% 。含HN的NIC储备液为溶液1。取l0片NIC片剂(20011101)称定后研细,称取约4片量置100mL量瓶中用缓冲液溶解,定容,滤过。此为溶液2。量取(溶液1)1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分别置25mL量瓶中,加(溶液2)8mL,加3mL NA液,缓冲液定容测定。数据列于表1。另作空白液:3次各取(溶液2)8 mL,分别置25 mL量瓶中,其余同上操作,测定。空白液含HN 2.334、2.298、2.311 mg/L,平均值2.314 mg/L,RSD=0.64% ;NIC 63.88、64.82、65.53 mg/L,平均值64.74 mg/L,RSD=1.04%。平均回收率:HN 98.4%,RSD=1.34% (n=5);NIC 100.6% ,RSD=1.63% (n=5)。
    3.5 样品测定
    取NIC若干片称定后,研细,称取1片量,置25mL量瓶中,加缓冲液适量溶解后加3mL NA液,用缓冲液定容,摇匀,滤过,待测。样品与对照品同法测定。
    NIC分子结构中硝酸乙酯键较活泼,片剂内的微量水分能使其缓慢水解,除水解物HN外,可能伴有少量NO2,使片剂外观由白色向类白色、微肉红色、棕色缓慢转变。NIC分解的多,外观色深。2000401片剂外观色深于99030、980901,用HPCE、UV测定,NIC含量均低于990301、980901。该片剂出厂晚,NIC分解的多,可能是它本身含水量高所致。
由表可知,uv法对含HN的NIC片剂测定结果高于HPCE。用这两种方法同时测定NIC对照品结果为:HPCE 100.13% ;UV 100.95% ;测定含HN的NIC留样药品:HPCE 85.8% ;UV 8.7%。NIC峰旁有一肩峰。可见,用UV法测定含HN的NIC,HN对NIC的测定有干扰。
    编号880905片剂,已放置14年,其电泳图仅有NIC、HN两个峰。若采用峰面积归一法对NIC片剂的质量直接进行定性、定量分析也不失为一种好方法。
    本实验曾用外标法测定(n=6):HN的相关系数r=0.99899,RSD=3.5% ,回收率98.8% ,RSD=2.6% ;NIC r=0.99968,RSD=2.018% ,回收率103.3% ,RSD=5.1%。外标法回收率的RSD大于内标法。故实验选用内标法。NIC、HN和NA在264±2nm处均有较大吸收,本实验测定选用此波长。
References
1 Mizumura T,Nithipatikom K,Gross G J.Cardiovasc.Res.,1995,29:482—489


作者: 2006-4-1
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