蜂胶HPLC指纹图谱及质量控制

[摘要]目的:研究蜂胶HPLC指纹图谱,对蜂胶进行质量控制。方法:采用RP-HPLC测定。结果:不同来源的蜂胶所含黄酮类成分之间的相似性较大,其差异较小。结论:可以采用HPLC 指纹图谱,对市场上蜂胶的品种和蜂胶保健品的真伪进行鉴别。
[关键词] 蜂胶;黄酮;HPLC指纹图谱;质量控制
蜂胶是蜜蜂采集植物树脂并混入上颚腺分泌物和蜂蜡而成的芳香固体物。蜂胶的化学成分复杂,迄今发现已有上百种之多,其主要化学成分为黄酮类、酚类。现代药理研究表明,其功效成分主要是黄酮类化合物,研究显示具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、消炎镇痛、防腐保鲜等多种功效,能增加机体免疫力,促进组织再生。目前蜂胶已越来越广泛地应用于医药、食品、化妆品等领域,主要品种有纯蜂胶、蜂胶粉等等。但市场上的蜂胶及其产品缺乏统一的质量控制标准,曾有文献报道测定了蜂胶中的黄酮类成分,包括有良姜素、高良姜素、芦丁、杨梅酮、桑色素、槲皮索、山柰素、芹菜素、柯因和松鼠素等。作者也曾经报道了不同产地蜂胶总黄酮含量测定方法及含量上的区别,但仅通过总黄酮的含量来控制蜂胶的质量还远远不够,因此,作者继续研究了不同产地蜂胶的HPLC指纹图谱,以期通过HPLC 指纹图谱来全面、有效地控制蜂胶质量,对市场上蜂胶及其保健品进行鉴别。
1 　仪器与材料
蜂胶由上海舜夏生物科技有限公司提供,主要来自河南、浙江和福建。槲皮素对照品(自制,经高效液相色谱分析,纯度≥98%),乙腈、甲醇均为色谱纯(Sigma公司) ,水为超纯水,其余试剂为分析纯。岛津LC-10ATvp 液相色谱仪(包括LC-10AT 色谱泵、SPD - 10Avp 紫外检测器、混合器、Class-vp 色谱工作站) ;超纯水制备仪(PALL公司) ;电子分析天平(METTLER AE200) 。
2 　方法
2. 1 　色谱条件
色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6mm×150 mm,3.5μm);流动相A:乙腈-甲醇(9∶1) ,流动相B: 20 mmol/L的醋酸铵溶液(用醋酸调pH至3.5),梯度洗脱,流速0.8mL/min,检测波长360nm ,柱温30℃。梯度程序为:0～10min ,从13%A 线性梯度至17%A ;10～50min,线性梯度至70%A;50～60min,线性梯度至100%A。每次运行结束后以初始流动相平衡色谱柱20min,以保证出峰情况稳定。
2. 2 　溶液的制备
供试品溶液的制备:精密称取蜂胶0.5g ,置25mL小烧杯中,分别用15mL 甲醇超声2次(每次30min),过滤,残渣用甲醇洗涤2次,过滤,合并滤液,置50mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀。对照品溶液的制备:精确称取槲皮素10 mg ,置50mL量瓶中,加甲醇使之溶解并稀释至刻度,配成0.2mg/mL的溶液。
2. 3 　方法学考察
为了考察分析方法的可靠性,以槲皮素的峰为内参比峰,其色谱峰(s)的保留时间和峰面积为l,计算其他各峰的相对保留时间和相对峰面积比值。
2. 3. 1 　精密度试验　取同一份供试品溶液,连续进样5次,检测指纹图谱,考察各主要色谱峰与内参比峰相对保留时间和相对峰面积的一致性,结果表明各主要色谱峰保留时间的RSD 均在1.0%以内,相对峰面积的RSD均在1. 5 %以内。
2. 3. 2 　稳定性试验　取同一份供试品溶液,分别在0 ,4 ,8 ,12 ,24h 进行检测。结果表明,各主要色谱峰相对保留时间无明显变化,RSD 均在1.4%以内;相对峰面积也变异较小,RSD 均在2%以内。
2. 3. 3 　重复性试验　取同一批号的供试品5份,按供试品溶液的制备方法,分别制成供试品溶液进行分析。结果表明,各主要色谱峰相对保留时间较稳定,相对保留时间的RSD 均在1. 1 %以内;相对峰面积也变异较小,RSD 均在2.5%以内。
3 　结果
3. 1 　测定方法
分别精密量取对照品溶液和各供试品溶液10μL ,注入液相色谱仪,记录50 min 图谱即得。以槲皮素的色谱峰(s) 的保留时间和峰面积为1,计算其他各峰的相对保留时间和相对峰面积比值。
3. 2 　不同来源蜂胶指纹图谱比较
按供试品溶液的制备方法操作,分别取各批药材制成供试品溶液,取10μL 进样。同前条件测定图谱,见图3。对不同产地的蜂胶指纹图谱比较选出10 个稳定的且具有代表的峰作为共有峰,见图1。各样品的指纹图谱较为相似,但各共有蜂面积的比值有明显不同。
4 　讨论与结论
4. 1 　本研究采用RP-HPLC 梯度洗脱的方法对蜂胶总黄酮进行研究,参考了相关文献的色谱条件,对其黄酮成分的分离取得了良好的效果。在对7批不同来源的蜂胶药材进行色谱分析的基础上建立了蜂胶的指纹图谱。
4. 2 　蜂胶中黄酮类化合物主要包括黄烷酮、黄酮醇类、双氢黄酮类,世界各地蜂胶样品中分离出来的黄酮类化合物已有70多种。其中黄烷酮主要有白杨素、杨芽黄素、芹菜素、刺槐素、木犀草素、柳穿鱼素、蜜橘黄素、福橘黄素等;黄酮醇类主要包括槲皮素、芦丁、山柰素、鼠李素、良姜素、高良姜素等;双氢黄酮类主要有乔松素、樱花素、柚皮素等。本实验采用甲醇超声溶解能够较好地提取黄酮类成分,绝大多数色谱峰的紫外吸收均显示为黄酮类成分的特征吸收,与文献报道的色谱图基本相似,10个共有峰相对保留时间符合程度较好,所测图谱能够反映出蜂胶的指纹特征。
4. 3 　不同产地的蜂胶指纹图谱有明显不同,峰数与相对峰面积相差较大,提示蜂胶用保健品应在固定产地的前提下,才能保证品质的一致性。
4. 4 　蜂胶是含有树脂状物的粘性物质,不溶于水,易溶于甲醇、乙醇和甘油等有机溶剂。经过反复筛选本文选定溶解性高、无干扰的甲醇为溶剂。为克服蜂胶的黏性、样品处理时需冷冻粉碎;在用甲醇溶解提取后,需要过滤,除去不溶性杂质。