关白附的HPLC指纹图谱

【摘要】目的:对东北产10个批号的关白附药材指纹图谱进行了比较。方法:应用RP-HPLC法,Diamonsil C18色谱柱,流动相为2mg/mL浓度的庚烷磺酸钠水溶液(含0.2%三乙胺并以H3PO4调pH至3.0)-乙腈二元梯度洗脱,速为1.0mL/min,检测波长205nm。结果:不同批号的关白附药材所含生物碱成分均得到很好的分离,确定了指纹图谱中10个共有峰,共有峰峰面积之和均大于各总峰面积的90%。结论:该方法可用于关白附的真伪鉴别和质量评价。
【关键词】关白附;指纹图谱;生物碱
关白附系毛茛科乌头属植物黄花乌头Aconitum coreanum (Lèvl1)Rapaics 的块根,又名白附子、竹节白附,具有祛风痰,定惊痫,散寒止痛作用,主治中风痰壅,口眼歪斜,癫痫,偏正头痛,为中医临床常用中药之一。近代药理研究表明关白附中主要有效成分关附甲素、关附庚素、关附壬素等生物碱类成分具有抗心律失常、抗炎和镇痛作用,盐酸关附甲素注射液作为我国独创的新药,是迄今批准进行临床试验的由我国研制的从天然产物中开发第一个抗心律失常药物(按西药一类) ,现经临床I、II、Ш期试验证明该药具有较独特的临床抗心律失常效果。有关关白附指纹图谱的研究目前尚未见文献报道,本实验对东北产10个批号的关白附药材进行了指纹图谱研究。
1 　仪器与试剂
Agilent 1100 高效液相色谱仪,DAD 检测器。乙腈(Merck公司,色谱纯) ,庚烷磺酸钠(百灵威公司,色谱纯) ,磷酸(分析纯) 、三乙胺(分析纯) ,重蒸水。
对照品:关附胺醇(GFAA)、关附壬素(批号:030517) 、关附甲素( GFA) 、关附Z 素( GFZ) 、关附庚素(GFI) 均为从关白附中分离制备得到,结构经UV、IR、MS 和NMR 鉴定;化合物经HPLC 检测纯度均达98.0%以上。
药材:关白附,经沈阳药科大学吴维春教授鉴定均为Aconitum coreanum (Lèvl.) Rapaics。
2 　方法与结果
2.1 　色谱分析条件
Diamonsil C18色谱柱,流动相A为2mg/ml浓度的庚烷磺酸钠水溶液(含0.2%三乙胺并以H3PO4调pH至3.0) ,流动相B为乙腈,采用梯度洗脱,梯度程序,流速为1.0mL/min ,检测波长205nm ,柱温20℃,经过与空白实验进行比较,所有组分在60min内洗脱出柱,洗脱时间延长至120min 亦无其它色谱峰出现。
2.2 　供试品溶液的制备
取各批关白附药材粉末(10～20目)各2g ,精密称定,置100mL具塞锥形瓶中,精密加入1%盐酸溶液50mL ,称定重量,超声30min ,放冷,再称定重量,用1%盐酸溶液补足减失的重量,摇匀,经0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
2.3 　对照品溶液的制备
精密称取关附胺醇、关附壬素、关附甲素、关附Z素和关附庚素对照品适量,加流动相使溶解配制成一定浓度,作为对照品溶液。
2.4 　指纹图谱的建立
2.4.1 　测定方法　分别精密量取对照品溶液和各供试品溶液20μL ,注入液相色谱仪,记录60min色谱图即得。以关附甲素的色谱峰(s) 的保留时间和峰面积为1,计算其它各峰的相对保留时间和相对峰面积比值。
2.4.2 　稳定性试验　取8号药材的供试品溶液,分别在0 ,2 ,4 ,8 ,16 ,24h 进样20μL检测,计算相对保留时间和相对峰面积,结果表明,供试品的指纹图谱在24h 内基本稳定,各色谱峰相对保留时间的RSD均在1.0%以下,相对峰面积的RSD为2.4%～4.5%。
2.4.3 　精密度试验　取8号药材的供试品溶液,连续重复进样6次检测,计算相对保留时间和相对峰面积,结果表明,各色谱峰相对保留时间的RSD均在1.0%以下,相对峰面积的RSD为1.7%～3.5%。
2.4.4 　重复性试验　取8号药材5份,分别制备成供试品溶液,进样检测,计算相对保留时间和相对峰面积,结果表明,各色谱峰相对保留时间的RSD均在1.0%以下,相对峰面积的RSD为2.2%～4.7%。
2.4.5 　不同批号关白附指纹图谱的比较　10批关白附药材测定结果。根据结果,比较各批样品的色谱图,确定了10个共有峰,共有峰峰面积之和均大于各总峰面积的90%,10批关白附的共有峰的相对保留时间的RSD均低于1.0%,但是相对峰面积的比值有明显不同,这也说明不同产地和采收时期对关白附药材的化学成分均有影响。
2.4.6 　关白附模式图谱的建立　利用中国药品生物制品检定所的《中药色谱图分析和数据管理系统》软件,对关白附指纹图谱的峰面积和峰高以及全图谱进行匹配,以第1批样品的HPLC图谱为参照,计算10批样品之间的相似度,计算结果表明10批样品在整体上相似,故以这10批样品的相对峰面积和相对保留时间的均值建立模式图谱。
3 　讨　论
关白附的主要有效成分为生物碱类,本实验采用1%盐酸溶液超声提取,通过比较超声20min、30min和40min所得结果,发现30min和40min提取得到的图谱各峰面积相差不大,但均高于20min 所得图谱,故采用超声30min进行提取。
不同批号关白附药材所含各有效成分基本相同,但是各成分含量差别较大,如果要保证药品的一致性,应注意药材产地和采收时间。
本实验通过一系列筛选,建立了较好的色谱洗脱条件,结果表明各色谱峰之间分离度良好,根据此方法所得到的关白附的HPLC指纹图谱重现性、精密度和稳定性均良好,确定了其中10个共有峰,并利用相似度软件对关白附指纹图谱进行匹配,结果表明东北产10批关白附在整体上相似,因此以这10批样品的相对峰面积和相对保留时间的均值建立了模式图谱,可用于关白附的真伪鉴别与质量评价。