川芎高效液相指纹图谱的建立

摘要目的:建立川芎药材的高效液相指纹图谱,以控制其质量。方法:色谱柱为Zorbax SB - C18 ,柱温为25 ℃,流速为1.0ml /min ,检测波长为323nm ,以甲醇和0.1 %冰醋酸水溶液进行梯度洗脱,考察不同提取方式对川芎药材指纹图谱的影响;进行等度洗脱,考察川芎药材在不同波长下的指纹图谱。结果:采用超声提取法进行梯度洗脱效果较好。结论:本方法可用于建立川芎药材的指纹图谱,且简便、可靠、重现性好。
关键词：川芎;高效液相色谱法;指纹图谱;质量控制
    中药川芎为伞形科植物川芎(Ligusticum chuanxiong Hort1) 的干燥根茎,味辛、微苦,性温,具有活血祛淤、行气开郁、祛风止痛之功效。临床上主要用于治疗心血管、妇科等疾病。为控制川芎药材的质量, 笔者按照国家药典委员会关于《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行) 的通知》要求, 并参考相关文献, 采用高效液相色谱法对川芎药材进行了指纹图谱研究。
1 仪器与试药
1.1 仪器：1100 高效液相色谱系统,包括四元泵、光电二极管阵列检测器(DAD) 、G137PA 自动脱气机、标准自动进样器、色谱工作站(美国Agilen 公司) ; 5200H 型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司) 。
1.2 试药：阿魏酸对照品(中国药品生物制品检定所, 批号: 0790 -200312) ; 川芎药材(产于四川灌县, 购于湖北省中药材有限公司, 并经武汉大学药学院张洪教授鉴定, 符合《中国药典》2000年版要求) ; 甲醇为色谱纯, 水为重蒸馏水, 冰醋酸及其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
2.1.1 超声提取法: 准确称取川芎药材粉末2.0g , 置于具塞锥形瓶中, 加95 % (V/ V) 乙醇50ml , 放置过夜, 超声提取20min , 过滤, 挥干溶剂后加20ml 水溶解, 再分别以20 、20 、10ml 乙酸乙酯萃取3 次, 合并萃取液, 挥干, 残渣加甲醇溶解并定容至10ml 容量瓶中,经0145μm 微孔滤膜过滤,即得。
2.1.2 甲醇回流提取法: 取川芎药材粉碎, 过60 目筛。再准确称取川芎药材粉末210g , 置于圆底烧瓶中, 加甲醇30ml , 并于70 ℃水浴中加热回流提取, 沸腾后保持1h 再停止加热。过滤至蒸发皿中,残渣按同法再反复提取1 次,过滤,合并2 次滤液,滤液浓缩后以甲醇定容至10ml 容量瓶中,经0.45μm 微孔滤膜过滤,即得。
2.2 对照品溶液的制备
    准确称取干燥至恒重的阿魏酸对照品适量, 加甲醇配制成0.2g/ L 的对照品溶液,色谱详见图1 。
2.3 色谱条件及分析方法
2.3.1 梯度洗脱: 色谱柱为Zorbax SB - C18 (250mm ×4.6mm , 5μm) , 流动相为甲醇和1 %冰醋酸水溶液进行梯度洗脱(其中, 甲醇与1 %冰醋酸水溶液体积比于0min～40min 时从10 ∶90 变化至35 ∶65 , 40min～60min 时从35 ∶65 变化至70 ∶30 , 60min～80min 时从70 ∶30 变化至100 ∶0) , 柱温为25 ℃,流速为110ml / min ,检测波长为323nm ,理论塔板数以阿魏酸计不低于5 000 ,进样量为10μl 。其中, 2 种提取方式下川芎药材的指纹图谱详见图2 。
2.3.2 等度洗脱: 色谱柱为Zorbax SB - C18 (250mm ×4.6mm , 5μm) ,分别采用甲醇- 水(30 ∶70 ,水中含015 %冰醋酸) 、甲醇- 水(40 ∶60 ,水中含0.5 %冰醋酸) 、甲醇- 水(20 ∶80 , 水中含0.5 %冰醋酸) 、甲醇- 水(30 ∶70 , 水中含1 %冰醋酸) 、甲醇- 水(40 ∶60 ,水中含1 %冰醋酸) 、甲醇- 水(20 ∶80 ,水中含1 %冰醋酸) 、甲醇和1 %磷酸水溶液(40 ∶60) 、甲醇-0.5 %磷酸水溶液(40 ∶60) 、甲醇- 0.25 %磷酸水溶液(40 ∶60) 的流动相进行等度洗脱,并分别考察323 、280、340nm 波长处的指纹图谱。结果,流动相为甲醇- 水溶液(30 ∶70 ,水中含0.5 %冰醋酸) 时的色谱较好。由图3 可知,A 、B 、C 分别为于323、280 、340nm 波长处所测得的色谱图。其中,A 中峰3 、5 分别为阿魏酸、川芎嗪,B 中7、9 分别为阿魏酸、川芎嗪,C 中峰3、5 分别为阿魏酸、川芎嗪。
2.4 同一产地川芎药材指纹图谱及各项技术参数
    根据比较测得的同一产地(四川灌县) 10 批药材(批号依次记为A 、B 、C……) 的指纹图谱,结果表明, 10 个峰是各批供试品所共有的, 且峰面积较为稳定, 故笔者确定其为主要共有峰。其中峰3 为阿魏酸的色谱峰,标为S(参照峰) ,相对保留时间、相对峰面积分别详见表1 、表2 。
3 讨论
    笔者比较了川芎药材超声提取和甲醇回流提取2 种提取方式对川芎有效成分指纹图谱的影响。由图2 可知, 2 种提取方式的主要有效成分的特征峰都为10 个, 主要特征峰所代表的有效成分相同, 但图2 (A) 比图2 (B) 分离度高, 作为柱效评价的重要指标———塔板数也比图2 (B) 高得多; 而且,在甲醇回流提取方式中, 甲醇有很大的毒性, 而超声提取利用乙醇为提取溶剂,则无毒、简便易行,因此超声提取的方法非常可行。
    由表1 可知, 色谱峰的相对保留时间匹配较好, 相对标准差均小于1 % , 符合规定; 由表2 可知, 相对峰面积的相对标准差均小于3 % ,说明指纹图谱的重现性良好。图3 中, A 、C 中特征峰较少, 说明等度洗脱不能使极性不同的组分得到很好的分离, 并且分离度与梯度洗脱相比小得多、塔板数也低得多, B 中峰数虽较多, 但前20min 峰较集中,影响了分离度, 而且峰形较梯度洗脱的峰形差。这是因为中药成分复杂, 利用等度洗脱很难将极性不同的组分全部洗脱下来,有些组分会残留在色谱柱内,对柱子不好,时间过长有可能会堵塞色谱柱。利用梯度洗脱则可以克服以上缺点, 因此在对中药材进行分析时最好采用梯度洗脱方式。
    由于中药材成分复杂、不同批次的质量相差悬殊、缺乏有效的质量控制措施等原因, 致使长期以来规范中药材市场秩序的举措收效甚微。因此, 制订新的中药材质量控制方案势在必行。中药指纹图谱是一种综合的可量化的色谱鉴别手段, 借以鉴别真伪,评价中药材、半成品和成品质量均匀性和稳定性,能更有效地控制中药材的内在质量, 提高中药材的稳定性。笔者采用高效液相色谱法, 建立了川芎药材的指纹图谱分析方法,结果表明,本方法稳定、可靠、重现性好,可用于川芎药材指纹图谱的建立,并可为其质量的全面控制提供参考。