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高效液相色谱-库仑电极阵列法检测山茱萸的指纹图谱研究

来源:药分网
摘要:摘要:采用高效液相色谱-电化学(库仑电极)阵列检测技术,以马钱素、熊果酸以及齐墩果酸为分析对象,对不同产地山茱萸的指纹图谱进行了初步研究。结果表明,该方法的重现性良好,从不同产地山茱萸指纹图谱比较得出结论,不但佛坪地区样品之间的相似度良好,而且全国各地山茱萸产区的样品也有较好的一致性。该方法简单、准确,可......

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摘 要:采用高效液相色谱-电化学(库仑电极) 阵列检测技术,以马钱素、熊果酸以及齐墩果酸为分析对象,对不同产地山茱萸的指纹图谱进行了初步研究. 结果表明,该方法的重现性良好,从不同产地山茱萸指纹图谱比较得出结论,不但佛坪地区样品之间的相似度良好,而且全国各地山茱萸产区的样品也有较好的一致性. 该方法简单、准确,可用于对山茱萸的质量控制.
关键词:山茱萸; 高效液相色谱; 库仑电极阵列检测技术; 指纹图谱
    山茱萸( Macrocarpium of f icinale) 是山茱萸科(Cornaceae) 山茱萸属( Macrocarpium) 植物的干燥成熟果肉,主产于我国的陕西、浙江、河南等省,四川、安徽、山东、山西亦有栽培. 山茱萸果肉药性微温,味酸涩,归肝,具有补益肝肾、涩精敛汗,固虚脱等功效,可用于治疗眩晕耳鸣,腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、虚汗、神经衰弱、内热消渴、月经不调等病症. 虽然山茱萸在我国栽培历史久远,但长期以来一直采用种子繁殖,且由于环境条件的差异,种内变异较大,导致现有结果树种良莠不齐,产量高低不一. 这样既不利于山茱萸的市场流通,也不利于山茱萸种质资源的保护和开发利用,而且成为限制其进一步走向国际市场的瓶颈.
    通过建立中药指纹图谱可以全面反映中药所含内在化学成分的种类和数量,进而反映中药的质量,是中药的一种新型的生产质量标准. 它可以确保药品的一致性,疗效的安全性及可靠性. 电化学( 库仑电极) 阵列检测器(elect rochemical detector) 是根据电化学原理和物质的电化学性质进行检测的仪器,在液相色谱中,它可以检测出所有电活性物质,因此,对那些没有紫外吸收或不能发出荧光但具有电活性的物质,可采用电化学检测法. 电化学阵列检测器提供准确而精密的样品特质分析,从中得到样品的三维图谱,即:时间、电势和浓度. 对排列的多个电极按逐渐升高的方式施加不同的电势,可更容易地检测出具有不同氧化还原电势的化合物,即使这些化合物的色谱性能相同,常规色谱法无法分开,也能检测. 杜昱光等利用高效液相色谱2电化学(库仑电极) 阵列检测技术,考察了不同处理时间植物体内内源激素的变化情况及其他小分子物质的差异显示,认为其具有很大的优势. 我们采用高效液相色谱-电化学( 库仑电极) 阵列检测技术,对不同产地山茱萸的指纹图谱进行了初步的研究,旨在为山茱萸药材质量控制提供科学的依据,为山茱萸的GAP(Good Agriculture Practice) 建设标准的建立提供参考.
1  材料和方法
1. 1  材料
    山茱萸科( Cornaceae ) 山茱萸属( Macrocarpium ) 山茱萸( Macrocarpium of f icinale S ieb. et Zucc. ) . 收集的样品见表1.
表1  山茱萸指纹图谱样品
Tab. 1  Samples of f ingerprints of Macroca rpium of f icinale
编号样品编号样品
1 陕西佛坪11 四川安县
2 陕西佛坪12 陕西太白
3 陕西佛坪13 河南内乡
4 陕西佛坪14 安徽亳州
5 陕西佛坪15 陕西周至
6 陕西佛坪16 贵 阳
7 陕西佛坪17 山西阳城
8 陕西佛坪18 浙江临安
9 陕西佛坪19 陕西陇县
10 陕西佛坪20 陕西丹凤
    实验用甲醇、乙腈均为色谱纯,购自美国Fishier试剂公司;标品熊果酸(Ursolic acid ,742 - 8701) 、齐墩果酸(Oleanolic acid ,0709 - 9803) 均购自中国药品生物制品检定所,马钱素(Loganin ,2423980) 购自SIGMA 公司;实验用水为高纯水.
1. 2  仪器
    高效液相色谱2电化学阵列检测系统,包括582型泵、542 型自动进样器、CoulArray 5600A 型电化学阵列检测器及CoulArray for Windows 色谱工作站( ESA 公司,美国) .
1. 3  标准品溶液的配制
    精密称取齐墩果酸标准品3. 2 mg ,置10 mL 容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得0. 32mg/ mL 齐墩果酸标准储备液.
    精密称取马钱素标准品4. 1 mg ,置10 mL 容量瓶中,用30 %甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得0.41 mg/ mL 马钱素标准储备液.精密称取熊果酸标准品5. 05 mg ,置5 mL 容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得1. 01mg/ mL 熊果酸标准储备液.
1. 4  样品溶液的制备
    精密称取山茱萸粗粉(40 目) 1. 0 g ,置25 mL容量瓶中. 加25 mL 甲醇,称重,超声处理30 min ,取出,放置至室温,称重并补足损失甲醇量,过滤,并用10 mL 甲醇清洗滤纸,合并滤液,置蒸发皿浓缩.转移至5 mL 容量瓶中定容,过0. 45μm 微孔滤膜后进样.
1. 5  液相色谱及电化学阵列检测器条件
    Kromasil C18 色谱柱( 4. 6 mm ×250 mm ,5μm) 及其C18 保护柱;流动相A :30 mmol/ L 磷酸二氢钠水溶液(pH 值为5) ,含5 %(体积分数) 乙腈. 流动相B :30 mmol/ L 磷酸二氢钠水溶液(pH 值为5) ,含70 %(体积分数) 乙腈. 流速1. 0 mL/ min.线性梯度洗脱,洗脱程序为:100 % A(保持30 min)100 min-30 % A 0 min-0 % A (保持40 min) . 十六通道电化学阵列检测器的检测电势为- 50~850mV ,以60 mV 递增.
2  结果
2. 1  对照品的选择
    马钱素为山茱萸中环烯醚萜甙类物质,电活性较强,为山茱萸中有效成分,故选为参照物之一. 熊果酸和齐墩果酸为山茱萸中主要有效成分,所以将熊果酸和齐墩果酸也选为参照物.
2. 2  图谱测定时间的确定
    取样品溶液,注入高效液相色谱2电化学( 库仑电极) 阵列检测仪,记录200 min 色谱图,结果表明170 min 后无样品峰出现,故确定图谱记录时间为170 min.
2. 3  稳定性及精密度试验
    取同一批山茱萸药材,按1. 4 方法制备供试品溶液,分别在0 、4 、8 、12 、24 h 连续进样5 次,记录指纹图谱,以齐墩果酸的保留时间与主通道和相邻通道的峰面积比值两个参数为参照,换算出各共有峰的相对保留时间和相对积分面积. 结果显示,样品溶液在24 h 内通过HPLC 分析结果稳定,共有峰的相对保留时间和相对积分面积相当一致,齐墩果酸的RSD 小于1. 5 % ,表明样品溶液在24 h 内能够保持较好的稳定性.
    取同一批山茱萸药材,按1. 4 方法制备供试样品溶液,连续进样5 次,记录指纹图谱,考察各共有峰相对保留时间及相对峰面积比值的一致性. 结果表明,供试样品溶液中齐墩果酸相对保留时间及相对峰面积的RSD 均小于3 % ,表明仪器等整个检测系统的精密度良好.
2. 4  重现性试验
    取同一批山茱萸药材,按1. 4 方法制备供试液样品5 份,分别记录指纹图谱. 结果表明,供试样品溶液中齐墩果酸的相对峰面积及相对保留时间的RSD 小于3 % ,表明方法重现性良好.
2. 5  HPLC 指纹图谱的相似度
    分别记录全国山茱萸产区的10 批样品和陕西佛坪产区的10 批样品的指纹图谱,根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》,以参照物齐墩果酸峰的相对保留时间和相对峰面积为1 ,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积. 根据20 批样品的相对保留时间及指纹图谱的整体谱峰特点对峰进行匹配,以相对峰面积的中值建立共有模式,以相关系数法进行样品的相似度评价. 结果表明,佛坪样品之间相似度良好;全国山茱萸产区的样品也有较好的一致性. 以陕西佛坪山茱萸指纹图谱共有模式与全国山茱萸指纹图谱共有模式相比较,计算相似度,结果表明陕西山茱萸与全国样品比较相似度较好.
3  讨论
    采用电化学阵列检测器检测化合物时,会在连续的通道上出现检测信号,信号最强的通道为主通道,其前一通道及后一通道的信号强度与该通道信号强度的比值即为“峰面积比值”. 在一定的电势条件下,每种化合物的“峰面积比值”是一定的,因此样品中各物质的定性采用保留时间和“峰面积比值”两个参数与标准品比较来确定. 其优势体现在以下两个方面: (1) 更高的检测灵敏度; (2) 较好的检测选择性. 单通道检测器需要大量的工作去选择色谱柱和流动相,以使样品中的所有化合物最大可能地分离开,但有时仍有共洗脱峰存在. 而库仑阵列检测器则可调节电极的电势,使共洗脱峰在不同的电极电势条件下检测. 高效液相色谱-电化学( 库仑电极) 阵列检测技术有望在中药指纹图谱的研究中发挥更大的作用.对不同产地的20 批样品分析结果表明,全国各地山茱萸产区的样品也有较好的一致性,佛坪地区样品的相似度高于不同地区的样品,说明如果要保证药材质量的稳定可控,固定产地具有重要的意义.
作者: 2006-7-14
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