金荞麦HPLC指纹图谱的研究

摘要目的: 建立金荞麦药材的HPLC指纹图谱。方法: 采用C18色谱柱,水(用磷酸调pH值至3. 00 ±0. 02) -乙腈(92∶8)为流动相,检测波长280 nm,柱温35 ℃。结果: 本研究建立的分析方法有较好的重复性,确定了金荞麦药材的11个共有峰,不同产地的金荞麦药材共有峰相对峰面积有一定的差异。结论: 本方法简单可靠,可用于金荞麦药材质量控制。
关键词　金荞麦药材;指纹图谱;高效液相色谱法
    金荞麦药材rhizoma fagopyri cymosi为蓼科植物金荞麦Fagopyrum dibotrys (D. Don) Hara 的干燥根茎,具有清热解毒、排脓祛瘀的功能,其有效成分为原花色素类缩合鞣质及其前体的混合物,包括: ( -) -表儿茶素[ (-) -ep icatechin ]及其衍生物的单体、二聚体和多聚体。本实验运用HPLC技术,对12个不同产地的金荞麦药材样品及金荞麦对照药材进行指纹图谱分析,有助于评价和控制金荞麦药材质量。
1 　仪器、试药与样品
    Waters 600E高效液相色谱仪、2487双波长紫外检测器、Millennium 32色谱管理系统,Varian cary 50 conc紫外-可见分光光度计, sartorius BP-11D电子天平, pHS225 型pH计(上海雷磁仪器厂) 。聚酰胺(柱层析用) 30 ～ 60 目, 批号F20000817,中国医药(集团)上海化学试剂公司。乙腈为色谱纯,乙醇、磷酸均为分析纯,水为去离子双蒸水。(-) -表儿茶素对照品(含量测定用) ,批号878-200001,中国药品生物制品检定所提供;金荞麦对照药材,批号1114-200001,中国药品生物制品检定所提供。
    金荞麦药材样品2～13号,由江苏省药品检验所和南通精华制药有限公司提供,经江苏省药品检验所鉴定为蓼科植物金荞麦Fagopy rum dibotrys (D. Don) Hara的根茎,产地分别为江苏、安徽、上海、浙江、江西、重庆、贵州、云南、河北。
2 　方法与结果
2. 1　色谱条件
    Symmetry C18色谱柱(5μm , 3. 9 mm ×150 mm) ;流动相∶水(用磷酸调pH值至3. 00 ±0. 02) -乙腈(92∶8) ,流速0. 8ml/min。检测波长280 nm,柱温35 ℃。理论板数按( -) -表儿茶素峰计算应不低于5 000。
2. 2　参照物溶液的制备
    精密称取(-) -表儿茶素对照品适量,加乙腈-水(1∶9)制成每1 ml含( -) -表儿茶素30μg的溶液,即得。
2. 3　供试品溶液的制备
    取本品粗粉约2. 5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%乙醇50 ml,密塞,称定重量,放置1 h,置水浴上加热回流1 h,放冷,再称定重量,用50%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液25 ml,减压浓缩至近干,残渣加乙腈2水(1∶9)分次洗涤,洗液转移至10 ml量瓶中,加乙腈-水(1∶9)至刻度,摇匀,离心(3 000 r/min ) 5 min,精密量取上清液5 ml,加入聚酰胺柱(30～60目, 3 g,内径1. 0cm,湿法装柱) ,以水30 ml洗脱,弃去水液,再用乙醇150 ml洗脱,收集洗脱液,减压浓缩至近干,残渣加乙腈-水(1∶9)使溶解并转移至10 ml量瓶中,加乙腈-水(1∶9)至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0. 45μm)滤过,取续滤液,即得。
2. 4　测定法
    分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,记录1 h色谱图。
2. 5　方法学考察
2. 5. 1　精密度与稳定性试验　
    取金荞麦药材供试品溶液(2号样品) ,在0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 24 h分别进样,记录色谱图。测得0, 1, 2, 3, 4 h进样的供试品溶液,各共有峰的相对保留时间和相对积分面积的RSD ≤1. 6% ,试验结果表明仪器性能良好;测得0, 2, 4, 6, 8, 24 h进样的供试品溶液,各共有峰的相对保留时间和相对积分面积的RSD≤3. 0% , 表明供试品溶液在24 h内能保持较好的稳定性。
2. 5. 2　重复性试验　
    取2号样品6份,按“2. 3”项下方法制备供试品溶液,分别进样,测得各共有峰相对保留时间和相对积分面积的RSD ≤3. 0% , 表明本方法具有较好的重复性。
2. 6　金荞麦药材HPLC指纹图谱及技术参数
2. 6. 1　指纹图谱选择及特征峰的标定　
    对金荞麦对照药材的供试品溶液进行测定,记录2 h色谱图, HPLC图谱显示57min之后没有色谱峰出现,因此确定记录1 h色谱图。对12个不同产地的金荞麦药材及金荞麦对照药材的供试品溶液,进行HPLC分析, 比较其HPLC图谱,确定11个特征峰为共有峰,其中特征峰6和(-) -表儿茶素峰积分面积相对较大。因( -) -表儿茶素对照品质量稳定,选择(-) -表儿茶素峰为参考峰,标号为S,其他特征峰依次标号为1, 2, ,10,不同产地金荞麦药材指纹图谱比较见图2。
2. 6. 2　特征指纹峰相对保留时间及积分比值　
    12个不同产地的金荞麦药材及金荞麦对照药材的供试品溶液测定结果表明,各指纹峰的相对保留时间均具有较好的重现性,其RSD≤1. 65% (表1) ;各指纹峰相对积分面积差异较大。
3　讨论
    试验中曾选用了多种流动相系统: ①0. 04 mol/L 枸椽酸溶液2N,N2二甲基甲酰胺2四氢呋喃; ②0. 05 mol/L 磷酸二氢钠溶液(磷酸调至不同的pH值) -甲醇; ③水(用磷酸调至不同的pH值) -乙腈-甲醇; ④水(用磷酸调至不同的pH值) -乙腈。结果表明:流动相以水(用磷酸调pH值至3. 00±0. 02) 2乙腈(92∶8)系统为最佳,各色谱峰分离度较好,保留时间适中。同时观察到流动相水(用磷酸调至不同的pH值) -乙腈系统,在下列范围内变化,水(用磷酸调pH 值至2. 80～3. 20) -乙腈( 9 ∶1, 91 ∶9, 92 ∶8) ,流速0. 8 ～1. 0 ml/min,供试品溶液色谱中,虽然各组分的保留时间有所变化,但不影响指纹图谱特征峰的识别与分析。
    方法学研究与样品测定结果表明:金荞麦药材指纹图谱检测方法合理可行,不同产地金荞麦药材指纹图谱特征峰的相对保留时间具有较好的重现性,可检测到金荞麦药材的特征成分的存在;由于受产地、气候和生态环境等因素的影响,各指纹峰相对积分面积差异较大,反映金荞麦药材的特征成分含量有差异,可据此评价金荞麦药材的质量。