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来源：生物工程学报
摘要:用国产高速逆流色谱（HSCCC）分离纯化中草药——丹参，选用正己烷-乙醇-水体系，固定相保留率达到78.8%。采用分步洗脱，3个产地丹参各分离得到12个洗脱组分，经高效液相色谱仪和紫外光谱仪检测证明3张HSCCC洗脱图谱中对应洗脱峰为同一组分。HSCCC洗脱图谱不包含非共有峰，并且对应洗脱峰保留时间的相对标准偏差RSD<3%，符合国家标准关于制订指纹图谱方法学考察资料的技术参数。因此，HSCCC作为制订指纹图谱的方法之一具有可行性。
高速逆流色谱（High-SpeedCounter-CurrentChromatography,HSCCC）是一种基于液—液多级逆流萃取建立的色谱体系，没有固相载体，避免了待分离样品与固相载体表面产生化学反应而变化和不可逆吸附[1]；高速逆流色谱可以直接纯化粗制样品；尤其适于分离极性较大的组分[2]；HSCCC的仪器及试剂成本明显低于高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC），适用于制备高纯度、高附加值的化合物。
中药材的主要活性成分是次生代谢物，对后天的生长环境依赖性很强，使得活性成分的种类和含量因地域、气候和采收期有较大的差异，迫切要求建立中药材的质量标准。中药指纹图谱是近年来被广泛采用的质控方法，它是运用现代分析技术对中药化学信息以图形（图象）的方式进行表征并加以描述[3]。每种分析方法只能表达中药材的部分化学信息，必要时可由多种方法来制订一组图谱共同构成指纹图谱。最常用的分析手段是色谱（薄层层析TLC、高效液相色谱HPLC和气相色谱GC）和光（波）谱（紫外光谱UV、红外光谱IR、质谱MS和核磁共振波谱NMR）。光谱和波谱指纹图谱由于选择性的限制，不能表达中药这样的混合体系中各种不同化学成分浓度分布的整体状况，因此色谱指纹图谱成为首选方法[4]。TLC操作简便、成本低廉，但精密度较差；HPLC精密度高，重现性好，适用范围较广，但需要有严格的样品预处理，很难分析易造成固定相吸附的样品和高粘度的样品；GC适用范围非常有限。因此本文提出使用高速逆流色谱（HSCCC）作为制订中药指纹图谱的方法之一。
选用丹参作为模式物。丹参具有活血通经、去淤止痛、清心除烦等功效，近来也被用于糖尿病的辅助治疗[5]。在以往的研究报道中，利用逆流色谱分离纯化丹参最多得到8种组分[6,7,8]。本文一方面摸索分离丹参适宜的溶剂体系和仪器参数，分离得到尽可能多的组分，使洗脱图谱中包含充分的化学信息，为制订指纹图谱打下基础；另一方面探索使用高速逆流色谱制订中药指纹图谱的可行性。
1、材料与方法
1.1仪器
1.1.1TBE-300半制备型高速逆流色谱仪（深圳同田生化技术有限公司，中国）。聚四氟乙烯管缠绕在3个水平轴上形成螺旋管（管直径2.6mm，分离体积300mL），进样圈20mL。高速逆流色谱配备了柱塞式泵（S系列，北京圣益通技术开发有限责任公司，中国），紫外检测仪（8823A，北京新技术应用研究所，中国），记录仪（3057型，四川记录仪器厂，中国）。
1.1.2高效液相色谱（10Avp系列，岛津，日本）：双泵系统（LC-10ATvp），紫外检测仪（SPD-10Avp），柱温箱（CTO-10ASvp），系统控制器（SCL-10Avp），控制软件（Class-vp），20μL进样圈；色谱柱：反向C18柱（150mm×4.6mmI.D.，5μm）。
1.2试剂
1.2.1高速逆流色谱试剂采用分析纯（天津化学试剂一厂）。水是通过反渗透Mili-Q（18MΩ，Milipore,USA）制备。
1.2.2高效液相色谱试剂采用一级色谱纯（FisherScientificCo.Ltd.,UK）。将反渗透处理过的水（18MΩ，Milipore,USA）通过0.45μm滤膜减压过滤后使用。标准对照品用高速逆流色谱的流动相配制成1mg/mL，经0.45μm滤膜过滤使用。
1.2.3丹参：来自3个产地：河北、山东、江苏。
1.2.4标准对照品：国家药品监督管理局，中国药品与生物制品检定所提供。
1.3丹参粗提物的制备
将丹参根或根茎粉碎成粗粉或细粉；20g丹参粉溶于50mL溶剂（正己烷:乙醇=1:1，V/V），充分搅拌45min，沉降后取上清；沉淀再溶于25mL溶剂，充分搅拌45min，沉降后取上清；离心10000g×10min，弃沉淀，留上清，定容；按1:2（V/V）的比例加水，在分液漏斗中摇匀，静置过夜，分相；取上相（有机相），定容；用2倍于有机相体积的30%乙醇洗至下相（水相）接近无色；取上相（有机相），在真空干燥器内充分干燥成干粉；分离前称量100mg用溶剂体系A的下相溶解，并通过超声振荡提高溶解度；离心10000g×2min，取上清上样[8]；粗提品收率约为2%。
1.4高速逆流色谱流动相的配制
溶剂体系A：正己烷:乙醇:水=10:5.5:4.5(V/V)，溶剂体系B：正己烷:乙醇:水=10:7:3(V/V)。
1.5高速逆流色谱分离步骤
分离纯化过程中采用溶剂体系A和B进行分步洗脱：将溶剂体系A的上相以9.99mL/min的速度泵入螺旋管使之充满，作为固定相；高速逆流色谱仪以900r/min的转速运转，同时以2.0mL/min的速度泵入溶剂体系A的下相，作为流动相；当流动相的前沿出现（即流出高速逆流色谱的出口端），说明两相平衡建立；用溶剂体系A的下相溶解粗提物，超声波助溶，离心后取上清，从进样阀上样6mL，100mg；洗脱过程中紫外检测仪在280nm连续监测；根据记录仪所显示的洗脱峰收集洗脱组分；洗脱470min后更换流动相为溶剂体系B的下相进行洗脱。
1.6高效液相色谱分析
标准品、洗脱组分均采用高效液相色谱分析。二元梯度洗脱：溶剂A（0.1%三氟乙酸，TFA），溶剂B（0.1%TFA+乙腈）。洗脱方式如下：0~5min，0%B；5~25min，0~70%B；25~40min，70%B；40~41min，70~0%B。流速1mL/min，检测波长280nm。每检测1个样品，以乙腈清洗色谱柱。
1.7紫外—可见分光光度计分析
标准品和洗脱组分采用紫外—可见分光光度计进行扫描，扫描波长：900-200nm。
2、结果与讨论
2.1高速逆流色谱分离纯化丹参粗提品
丹参的有效成分主要分为两类：脂溶性化合物和水溶性化合物，大多数的活性成分集中在脂溶性化合物中，因此本文仅限于研究丹参中脂溶性化合物的分离和纯化[9]。用HSCCC分离纯化河北产丹参，研究溶剂体系和仪器参数。提高HSCCC转速、降低流动相流速有助于提高固定相保留，使系统的分辨率得到保证，同时兼顾运行时间，确定HSCCC转速为900r/min，流动相流速为2mL/min，固定相保留率达到78.8%。(1)采用一步法洗脱，即自始至终用溶剂系统A的下相，整个洗脱过程耗时18h，各洗脱峰分离度较好，但最后2个峰的峰宽增大，灵敏度下降；(2)采用分步洗脱：在210min前用溶剂系统A的下相作为流动相，之后换为系统B的下相，运行时间缩短至9h，更换流动相后的2个洗脱峰分离度明显下降Rs<0.8；(3)为改善分离度调整分步洗脱的条件：在470min更换流动相为体系B的下相，运行时间为12h，分离度Rs>1.25。在达到较好分离度的基础上，尽量缩短运行时间，因此采用方法3，即0~470min以溶剂体系A的下相为流动相，470min后以体系B的下相为流动相。采用以上条件对另2个产地的丹参粗提物进行了分离纯化。图1显示了3个产地的丹参样品经高速逆流色谱分离纯化的洗脱曲线，各得到洗脱峰12个，利用国产HSCCC可以有效地分离纯化丹参。
2.23张洗脱图谱中洗脱峰的对应性
3个产地的丹参经HSCCC纯化，各得到12个洗脱峰，峰的数目一致，但必须确定3张洗脱图谱中对应的洗脱峰是否为同一组分。对各洗脱峰进行分析：依方法1.6测定各洗脱峰在反相高效液相色谱（HPLC）上的保留时间；依方法1.7在紫外-可见分光光度计900-200nm范围对各洗脱峰进行全波长扫描，得到吸收光谱。由表1和2可见，3条HSCCC洗脱曲线中的洗脱峰1和2的保留时间及吸收波长相似，但没有足够的证据认为洗脱峰1和2为同一物质。从HPLC保留时间和紫外吸收光谱还可判定，3个产地丹参洗脱曲线中的第n（n为1-12）个洗脱峰为同一组分。也就是说，3个产地丹参的HSCCC洗脱图谱，不但洗脱峰个数一致，而且对应洗脱峰为同一组分。
2.3高速逆流色谱作为制订指纹图谱的方法之一
从3个产地丹参的HSCCC洗脱图谱可以计算出，对应洗脱峰虽为同一组分但峰面积的百分比不同，也就是组分的相对含量不同，如表5所示。以洗脱峰7为例，河北的丹参相对百分含量为5.28%，山东的为20.17%，江苏的为9.07%。含量因产地、气候、采摘期等原因有了较大的区别，由此可见建立中药指纹图谱控制中药质量、监测中药有效成分是十分必要的。
中药指纹图谱的建立通常依赖高效液相色谱法和薄层层析法，本文提出将HSCCC作为建立指纹图谱的方法之一。在2.2中已得出结论：3个产地丹参的HSCCC洗脱图谱，不但洗脱峰个数一致，而且对应洗脱峰为同一组分，这是利用HSCCC建立指纹图谱的基础。因不存在非共有峰，且12个洗脱组分分别对应，初步将这12个洗脱组分定义为共有指纹峰。由表6可见，HSCCC法建立的指纹图谱各共有指纹峰保留时间的相对标准偏差（Relativestandarddeviation,RSD）最大为2.88%，平均为2.48%，符合国家标准关于方法学考察资料技术参数对RSD≤3%的要求。因此，HSCCC作为制订指纹图谱的方法之一具有可行性。
在制订指纹图谱的实践中，适宜使用内容积50mL的分析型HSCCC，并控制运行温度，可以大大缩短运行时间，并提高精密度。本研究因实验条件所限选用半制备型HSCCC，它可以在制订出指纹图谱的同时，制备足量样品供结构鉴定及活性鉴定用。
3.结论
不同产地、气候、收获期对中药材有效成分的含量甚至种类有一定的影响，所以需要建立指纹图谱来控制中药材质量。以丹参为模式物，利用国产高速逆流色谱有效地进行了分离纯化，得到12个洗脱组分。比较各洗脱组分在反相层析中的保留时间和吸收光谱峰值，认为3条HSCCC洗脱曲线中各组分依次对应。这就具备了将HSCCC用于制订指纹图谱的重要基础。3条洗脱曲线中不存在非共有峰，初步将这12个洗脱组分定义为共有指纹峰，各指纹峰相对保留时间的相对标准偏差RSD均<3%，符合国家建立指纹图谱方法学考察资料的技术参数。如果采用分析型HSCCC，并对温度进行控制，HSCCC的精密度有望得到明显提高。
将HSCCC用于制订中药材指纹图谱的实际操作中还须依照国家标准，建立检测方法的方法学考察资料，包括：供试品的稳定性实验（同一供试品在不同时间检测），仪器的精密度（同一供试品连续进样5次以上），实验方法的重现性（同一批号的供试品5份以上）等等。HSCCC对高粘度样品和易造成填料吸附的化合物的分离有较大优势，其仪器及常用试剂十分廉价易于推广，作为建立指纹图谱的方法具有可行性。