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来源：中国色谱技术网
摘要:目的：用RAPD方法对康定虫夏、人工虫草及虫草发酵菌丝体进行指纹图谱的研究,为不同虫草的品质和药效差异提供分子依据。方法：从65个随机引物中筛选出7个引物,以这7个引物进行PCR扩增,电泳得到其指纹图谱。结果：没有发现任何两个样本拥有完全相同的RAPD标记,康定冬虫夏草和人工虫草具有较高的遗传多态性,而与虫草发酵菌丝体相比差异较大。结论：来自不同产地冬虫夏草群体均表现出其独特的RAPD标记,其差异可能系虫体的不同所致。随机扩增的DNA片段的差异是否预示其药效的不同,有待进一步研究。
关键词:冬虫夏草;RAPD;指纹图谱
虫草属Cordyceps(Fr.)Link是一大类昆虫病原真菌,其特定的菌感染特定的昆虫后就会成为具有重要的药用价值的冬虫夏草C.sinensis(Berk)Sacc.。近年来,发酵培养和人工冬虫夏草成为热点,引发了关于冬虫夏草无性型的学术争论,国内已报道与冬虫夏草有关的丝孢菌,多达10属16种。此外,人工培养的菌丝体种类也较多。这些菌种与真正野生型菌种的关系如何?用什么样的技术手段来证明就成为当今研究的一个难题。传统的方法一是从菌丝体的各种生活阶段的形态学上进行比较;另一种方法是在实验条件下,将用各种途径分离获得的假定无性型,人工感染寄主昆虫,诱发形成具有成熟子囊壳的虫草子实体,然后再进行比较。但由于操作等方面的技术原因,迄今很少能完成这一程序。本实验拟应用RAPD方法来区分康定冬虫夏草与人工冬虫夏草及发酵菌丝体,并分析它们之间的相关性。
1、材料与方法
1.1材料:康定虫草购自四川省甘孜州康定地区。人工虫草及发酵菌种均为我院自行孵育和发酵的品种,菌虫种源来自四川阿坝州。
1.2仪器与试剂:PE4800PCR扩增仪(美国PE公司),Power-Pac300电泳仪(美国Bio-Rad公司),电泳槽(北京六一仪器厂)。随机引物及PCR试剂盒(上海Sangon公司),EcoR-Ⅰ和HindⅢ分子量标准品(Prommiga公司),琼脂糖(Bio-Rad公司),其他为市售分析纯试剂。
1.3方法
1.3.1虫草DNA提取:取虫草粗粒干品约110g,用灭菌TES缓冲液浸泡4℃过夜。其中换液两次,去除部分可溶性色素。离心去上清液,将样品及乳钵一起于-20℃冷冻1h以上,取出后迅速粉碎成粉。加2mL于60℃预热的抽提缓冲液[2%CTAB,1.5mol/LNaCl,0.2%巯基乙醇,20mmol/LEDTA(pH8.0),100mmol/LTris-HCl(pH8.0)],60℃提取1～2h,其间混摇数次。离心,去沉淀,上清液用酚和氯仿各抽提2次,取水相,加1/10体积醋酸钠、等体积异丙醇,沉淀出白色絮状DNA。75%乙醇洗两次,置75%乙醇中保存,或溶于适量TE备用。
取DNA溶液100mL,加1mLRNA酶(20mg/mL),37℃保温1h,加3倍体积5mmol/LNaCl,30μL玻璃粉混匀,放置30min。随时混摇,10000r/min离心2min。加洗液(0.2mol/LNaCl,10mmol/LTris-HCl,pH8.0,2mmol/LEDTA,50%乙醇)400μL混匀,离心,弃上清液,重复洗3次,加150μLTE缓冲液,55℃保温15min,混摇几次,离心,取上清液于-20℃保存备用。
1.3.2模板DNA的浓度及质量检测:DNA的浓度和质量的检测使用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳的方法,测定DNA提取液在260、280nm波长处的紫外吸光度(A)值,计算A260/A280值,估算其纯度;电泳时用0.8%琼脂糖凝胶,0.5μg/mLEB染色,测定DNA样品的纯度。
1.3.3引物筛选:按引物GC含量不同随机挑选出65个S系列引物,从提取的DNA模板液中任选一个为模板,对所有引物进行PCR扩增,选出电泳条带清晰、数目尽可能多的引物。重复一次,最后确定可重复的、条带相对清晰的引物7～8条为最终的实验用引物。
1.3.4PCR扩增反应:以不同样品所提取的DNA为模板,在以下反应体系中扩增:25μL的反应体系中包括10倍量稀释的PCR缓冲液2.5μL,25mmol/LMgCl2为1.5μL,4种DNTPS(各2.5μLmmol/L)为2μL,3μL引物(0.18ng),模板DNA为4μL(约5～25ng),Taq酶4U,灭菌去离子水12μL。
扩增程序:95℃预变性5min,PCR循环40次,每循环为94℃变性45s,36℃退火1min,72℃延伸2min,最后72℃延伸7min。
PCR检测:1.2%琼脂糖电泳,加入DNAEcoR-Ⅰ和Hind-Ⅲ为分子量标准,溴化乙锭(EB)的质量浓度为0.5μg/mL,电压为4V/cm,稳压电泳约2h,在紫外透射仪上观察、照相。
2、结果与分析
2.1康定冬虫夏草与人工冬虫夏草比较:从65个引物中筛选出7个,使用其中6个能够产生清晰而且呈现多态性条带的引物,按前述RAPD方法,得到12个受试样本,对其进行统计分析。在供试材料中共获得138条DNA扩增片断,每条引物所能扩增的条带在8～14条,平均每条引物扩增的DNA带数为1114条,其中916条具有遗传多态性,约占总数的84.0%;产生的DNA片段主要分布在0.5～5kbp区域,少数片段小于0.5kbp或大于5kbp。康定冬虫夏草与人工冬虫夏草的指纹图谱相比较,两者的相似率较高,说明两者分子基础有较大的相似之处。是否在药效方面也相似值得进一步研究。
2.2康定虫草与发酵后返接菌种及康定虫草中分离纯菌种比较:应用筛选出的5种引物,增加一个S80引种,其序列为ACTTCGCCAC(5′23′);从指纹图谱可以看出:康定虫草与发酵菌种相比,共产生DNA片断106条,其中共有DNA片断平均为616条,多态性标记占62.3%。结果表明虫草与菌丝体的共有标记较少,差异部分可能更多的是来源于虫草的虫体部分的DNA。
而发酵菌种与康定虫草中分离纯化菌种相比,共产生DNA片断107条,共有片断平均916条,多态性89.7%,表明两者之间菌种部分很可能是同一品种,因为其DNA指纹相似率较高。但菌丝体感染昆虫后,作为冬虫夏草的DNA提取物与菌丝的DNA指纹相似率大大下降,说明昆虫的DNA对菌丝体DNA有较大干扰。
3、讨论
结果表明,RAPD技术显示了极好的分辨率,没有发现任何两个样本拥有完全相同的RAPD标记,不同来源的冬虫夏草群体表现出其独特的遗传多态性,这种多态性可能系虫体的不同所致。由此可见,RAPD技术是从分子水平研究虫草之间相互关系的有效方法。不同来源的虫草或菌丝体存在着明显的遗传分化,在一定数量引物的实验中,没有发现任何两个样本具有完全的RAPD标记,但亲缘关系较近的,则共有标记较多,而不同的标记能否作为不同来源样本的特征性鉴定条带,以供鉴定不同来源的虫草正在进一步的研究当中。天然康定虫草与本院生产的人工虫草RAPD指纹有较大的相似之处,提示两者的药用或营养价值可能相似。说明虫草的菌种相同,虫体也一致,且生长环境相近似时,天然冬虫夏草与人工虫草的分子水平相差不太大;进一步比较天然虫草与发酵菌丝体的DNA指纹,相似率并不高。但分离纯化的菌丝与发酵菌丝体的DNA比较有较大的相似率(89.7%)。说明虫部的DNA差异是造成相似率差异的主要原因。提示进行DNA指纹比较时,材料来源部位一致性很重要。