猪肥胖基因（Ob）及其表达产物的研究进展

　　肥胖基因（Obese，Ob）于1950年首次在小鼠体内被发现，为常染色体隐性遗传。Zhang  Y等人通过定位克隆技术从C57BL／6J（B6）突变系小鼠体内获得小鼠Ob基因cDNA的完整序列，从而掀起了0b基因的研究高潮。肥胖基因的产物——瘦蛋白（Leptin）是由脂肪组织分泌的反映体脂含量和调节体重、摄食的重要信号因子。文章综述了最近国内外猪Ob基因及其表达产物的研究进展。



　　1    猪Ob基因的结构



　　猪Ob基因的研究首先是依据人、小鼠Ob基因cDNA序列设计引物，用RT-PCR扩增片段，再进行克隆和序列分析。Ob基因长约20  kb，由3个外显子和2个内含子组成，其编码区位于第2和第3外显子。在5′侧翼区域中包含了TATA盒样的序列和数个顺式调控元件（3个拷贝的GC盒、AP-2结合位点和C／EBA结合位点）。Ob基因编码长约4.5  kb的mRNA，含1个高度保守的能编码167个氨基酸的开放阅读框架，其5′端有长97bp的先导序列，3′端有长3.7  kb的非翻译序列。



　　猪Ob基因定位于18q24。Sasaki  S等人通过对欧洲野猪×大白猪、梅山猪×大白猪的3个世代参考家系猪群的连锁分析和体细胞杂交的方法，将猪Ob基因定位于18号染色体上，同时还发现Ob基因Aci  Ⅰ限制性酶切位点的多态性。次年，Sasaks  S等人又扩增了猪Ob基因的1个152bp片断，并用Hind  Ⅲ酶切，发现2个等位基因。Neuenschwander  S等人利用猪的特征性引物进行PCR扩增，通过体细胞杂交，也将猪Ob基因定位于18号染色体上。



　　2    猪Ob基因的克隆及其表达



　　2.1    猪Ob基因的克隆



　　1997年，Bidwell等人成功地克隆了猪Ob基因。Ramsay  T  G等人对猪Ob基因cDNA序列进行测定时发现，猪Ob基因与啮齿动物有85%同源，与人有88%同源，与牛有92%同源。Jiang  Z  H等人用Bi-PASA方法分析了杜洛克、汉普夏、大约克和长白猪Ob基因的多态性。结果发现，Ob基因有4个单碱基多态性，它们分别位于基因的867（C／T）、1112（A／G）、3469（C／T）和3714（G／T），其中前2个在基因的内元，后2个在基因的外元，且3  469位点的多态性可能与膘厚相关。



　　戴茹娟等首次报道猪Ob基因的全长序列，并对不同物种Ob基因的同源性进行了比较，试验以λUni-ZAP为载体构建了猪脂肪cDNA文库，并以用RT-PCR从脂肪RNA中扩增的长366bP的猪Ob基因片段作为探针，首次获得长3  277  bp的猪Ob基因cDNA的克隆序列。序列分析表明，猪与人Leptin氨基酸的同源性（86.0%）高于鼠与人之间的同源性（84.0%），这表明猪与人的核苷酸序列在进化上更为保守。许玲玲等通过Southern杂交和杂交阳性片段的克隆进行测序，首次得到猪Ob基因内含子1和5′调控区16.4kb序列，将外显子1定位在起始蜜码子上游11.1kb处，同时在内含子1中发现2个新微卫星，分别命名为SW160。调控区潜在的调控元件分析显示：-1—-300  bp区间包含C／EBP和2个Spl，能更直接、高效的调节其转录。



　　2.2    猪Ob基因的表达



　　Ob基因的表达具有组织特异性，同一个体不同部位的脂肪组织中Ob  mRNA的水平不同，皮下脂肪明显高于大网膜、肠系膜、后腹膜等部位的脂肪；在不同物种中表达瘦素的部位也有一定差别，猪Ob基因表达范围较宽。



　　戴茹娟等利用RT-PCR技术分析了Ob基因在不同组织中的表达和分布。研究表明，猪Ob基因在脂肪组织中大量表达，明显高于其他组织。同时，研究也意外发现猪Ob基因在肝脏、心脏、脾脏、肌肉组织中也有微量表达，这与人和鼠的研究报道有极大差异。Ob基因主要在人和鼠的脂肪组织中表达，而在其他组织中，无论是用Nothern杂交还是用RT-PCR均不能检测到Ob基因的转录物。猪Ob基因的表达存在性别差异，周杰等引发现，二花脸猪血清Leptin水平与脂肪组织Leptin基因的表达均具有明显的性别差别，总体上母猪高于公猪、这与在人和啮齿类动物的结果一致。



　　3    猪的瘦蛋白受体（Ob-R）基因



　　1995年，Tartaglia  L等人首次报道了小鼠脉络丛中Ob-R基因的识别和克隆表达，试验利用碱性磷酸酶（AP）标记重组Leptin，将Leptin-AP注入体内来识别Ob-R基因。研究表明，Leptin的结合位点可能位于脉络丛，Tartaglia  L等人还建立了小鼠脉络丛cDNA文库，对Ob-R基因进行识别和克隆，0b-R基因的图谱表明，该基因位于小鼠的4号染色体上，其座位内包含糖尿病基因。Chen  H等人证实了这个结论，并认为Ob-R基因是一种跨膜受体，与Leptin有很高的亲合力，小鼠来源的Ob-R基因有894个氨基酸，由于Ob-R基因组序列中的C→T的点突变而使Ob-R基因的阅读框架发生改变。



　　WinickJ  D等人将人的Ob-R基因定位于HSAIP区，Ernst等人利用体细胞杂交桔术首次将猪的Ob-R基因定位于6q区。胡晓湘等人对猪Ob-R基因的部分序列进行了克隆与分析，研究表明，猪与人、鼠的核苷酸同源性分别为89.3%和80.3%，氨基酸同源性分别为80.3%和76.6%。



　　樊明欣等研究表明，猪脑内Leptin长型受体（Ob-Rb）mRNA与生长抑素（SS）共存于下丘脑腹内侧核、背内侧核、室周核、室旁核、外侧区、视交叉上核、视上核及边缘系统的杏仁核和海马结构等部位，说明在猪下丘脑内存在表达Ob-Rb  mRNA的SS神经元，这为Leptin调节生长提供了进一步的形态学证据。



　　4    Leptin的生物学效应



　　4.1    Leptin调节繁殖性能



　　Leptin对生殖的调节可能是多种因素综合作用的结果：一方面Leptin直接作用于生殖中枢，另一方面Leptin的mRNA受体在卵巢、子宫和罩丸中高度表达，提示这几种牛殖器官可能是Leptin作用的靶器官，Leptin可直接作用于生殖器官参与生殖的调控。



　　据研究，大多数学者认为Leptin是通过下丘脑-垂体-性腺轴起作用，在性腺水平上，Leptin可直接与受体结合，但在下丘脑—垂体水平上，Leptin如何通过血脑屏障到达大脑和垂体是其发挥作用的关键。Leptin借助于脑脉络丛内的Ob基因受体介导的转运机制到达大脑，这一转运过程存在饱和性。Leotin从脂肪组织分泌出来后通过脉络丛进入脑脊液，随着脑脊液流入第三脑室（3v），然后再通过室管膜扩散进入下五脑，与室旁核和弓形核上的Leptin受体结合。进入下丘脑的Leptin从门静脉毛细血管进入正中隆起缺乏血脑屏障的部位，毛细血管里其余的Leptin由长门静脉转移到垂体前叶。另一部分Leptin借助于供应神经囊体的动脉血直接转移到垂体的神经叶，又随短门静脉到达垂体前叶，从而发挥其调控机制。



　　4.2    Leptin调节脂肪的沉积



　　目前，认为Leptin可通过3种途径调节脂肪的沉积：①抑制食欲，减少能量摄取。1995年，Anll等人用ob／ob小鼠做试验，研究Leptin与食物摄入量的关系，发现，食物摄入量与Leptin之间呈现剂量效应关系。现在认为作用于下丘脑的弓形核，其上至少有2种独特的神经元细胞能抑制食欲。第一种能产生神经肽（neuropeptide  NPY）和AgRP（agouti-related  protein），第二种能产生抑制食欲的神经POMC和CART（proopiomelanocortin  and  cocaine  and  amphetamine  regulated  transcript）。这2种神经都表达Leptin受体，但作用方式却是相反的。Leptin激活POMC／CART，但抑制NPY／AgRP。NPY增加，POMC减少，将能增加食欲和脂肪沉积；NPY减少，POMC增加，将能减少食欲和脂肪沉积。②增加能量消耗。Leptin不仅能降低食欲，而且能刺激交感神经系统，交感神经兴奋可分泌儿茶酚胺，与β肾上腺素受体（βAR）结合，刺激机体棕色脂肪产热，消除过多体脂，达到消耗能量的目的。③抑制脂肪合成，促进脂肪分解。Leptin通过βAR激活解耦联蛋白1在褐色脂肪组织中的表达作用，使机体产热，从而达到分解脂肪的目的，并且间接控制解耦联蛋白3在肌肉巾的表达。



　　5    展望



　　在育种实践中发现，猪的瘦肉率的选样提高总是与饲料采食量降低相联系，这一现象尤其是在猪自由采食时更明显，原因可能是Leptin蛋白的表达和作用是被紧连在一起调控的。猪Ob基因有可能是潜在的影响体脂含量、摄食量和饱食感的一个数量性状位点。另外，可以针对Ob基因进行限制性片段长度多态性（RFLP）、微卫星、PCR-SSCP、SNPs等多种分子标记研究，从而提高家畜生产水平。



　　目前，对肥胖调节的认识主要来源于ob／ob小鼠。而猪与人Leptin蛋白氨基酸的同源性（86.0%）高于鼠与人的同源性（84.0%），表明猪与人的核苷酸序列在进化上更为保守。对猪Ob其因的分析使其有可能成为研究人类肥胖病的有利动物模型。