重组蛋白纯化的基本策略生化与分子技术 | 39康复网

三阶段纯化策略纯化问题所涉及的具体步骤最终取决于样品的性质。但也有共同可参考的阶段捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。分离方法的选择根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：

蛋白质的性质	方法
电荷（等电点）	离子交换（IEX）
分子量	凝胶过滤（GF）
疏水性	疏水（HIC）反相（RPC）
特异性结合	亲和（AC）

　　　　　每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：

技术	主要特点	捕获	中度纯化	精制	样品起始状态	样品最终状态
IEX	高分辨率高容量高速度	★★★	★★★	★★★	低离子强度样品体积不限	高离子强度或pH改变。样品浓缩
HIC	分辨率好容量好高速度	★★	★★★	★	高离子强度样品体积不限	低离子强度样品浓缩
AC	高分辨率高容量高速度	★★★	★★★	★★	结合条件特殊样品体积不限	洗脱条件特殊样品浓缩
GF	高分辨率（使用Supedex）		★	★★★	样品体积（<总柱体积的5%）和流速范围有限制	缓冲液更换（如果需要）样品稀释
RPC	高分辨率		★	★★★	需要有机溶剂	在有机溶剂中，有损失生物活性的风险

　提示： 1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。 2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。 3、GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、HIC、AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。 4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或／和处理量的方法 5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。 6、只要目标蛋白耐受的情况下，可以考虑采用RPC方法用于精制阶段。注：应该指出，三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。附：纯化工艺路线　

作者： 2007-9-25