细胞的传代培养

　　一、原理

　　细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。

　　传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

　　二、材料和试剂

　　1、细胞：贴壁细胞株

　　2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）

　　3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等

　　三、操作步骤

　　1、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。

　　2、加入0.5—1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。

　　3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。

　　观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。

　　4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。

　　附：消化液配制方法：

　　称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。

　　胰酶溶液中也可加入EDTA，使最终浓度达0.02％。