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(一) 原理
(二) 操作步骤
胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)
↓
用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度为
5×106~1×107/ml
↓
取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5~50μl)
的小玻璃管或塑料离心管,再加50μl 1∶20(用DPBS
稀释)灭活正常兔血清
↓4℃ 30min
用洗涤液洗涤2次,每次加洗涤液2ml左右
1000rpm×5min
↓
弃上清,加入50μl工作浓度的羊抗鼠
(或兔抗鼠)荧光标记物,充分振摇
↓ 4℃ 30min
用洗涤液洗涤2次,每次加液2ml左右
1000rpm×5min
↓
加适量固定液(如为FCM制备标本,一般加入
1ml固定液,如制片后在荧光显微镜下观察,
视细胞浓度加入100~500μl固定液)
↓
FCM检测或制片后荧光显微镜下观察
(标本在试管中可保存5~7天)
(三) 试剂和器材
1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体,灭活正常兔血清。
3. 10% FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
(四) 注意事项
2. 洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。
附:
1. DPBS (×10, 贮存液)
NaCl 80g
KCl 2g 蒸馏水加至1000ml
Na2HPO4 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释
KH2PO4 2g
2. 洗涤液
DPBS 900ml
FCS 50ml (终浓度 5%)
4%NaN350ml (终浓度0.2%)
3. 固定液
DPBS 1000ml
葡萄糖 20g (终浓度2%)
甲 醛 10ml
NaN3 0.2g (终浓度0.02%)