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活化的巨噬细胞(M)在抗肿瘤过程中具有十分重要的意义。一氧化氮(NO)作为活化的M的细胞毒效应分子之一，在杀伤肿瘤效应中起重要作用［1］。本研究通过测定肺M内诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及其产物NO水平，并应用特异性NOS抑制剂来观察肺M对肿瘤细胞杀伤作用的影响，旨在探讨肺M NOS活性与肿瘤杀伤力之间的关系，以阐明肺M在抗肿瘤免疫中的地位。
1 材料和方法
1.1 肺M的制备及培养 体质量20～25 g的纯种C57雄性小鼠32只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,随机分成实验组和对照组，每组16只，均经腹腔注入2%戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉放血处死,暴露颈部气管后,用37℃生理盐水进行支气管肺泡灌洗,每次1 ml,共15次。将回收的灌洗液以1 500 r/min离心10 min,弃上清,用含10%小牛血清的最低必需培养液(MEM)配成 1×106个/ml的细胞悬液。将细胞悬液接种于96孔板中,37℃,5% CO2培养2 h,洗去未贴壁细胞,根据需要分别加入不同剂量(50，100，150，200 U/ml)的干扰素γ（INFγ）,继续培养24 h。
1.2 肿瘤细胞培养上清液的收集 将无菌取得的肥大细胞肿瘤细胞 P815 (上海肿瘤研究所提供)以 5×105个/ml的密度培养在RPMI 1640培养液中,置37℃,5% CO2培养箱培养48 h, 2 500 r/min离心20 min,取上清液,置-20℃保存待用。
1.3 iNOS活性测定 用Smith薄层层析法［2］测定上清液培养标本中瓜氨酸 (citrulline)的生成量，以此反映iNOS的活性。
1.4 NO测定 10 mmol/L硼酸钠溶液系列稀释10 mmol/L亚硝酸钠，测定其相应于波长为545 nm时的光密度(D)值,作曲线,并得出直线回归方程式［3］。取上清培养液，加入等量的Greiss试剂（1%磺胺、0.1%萘乙二胺、2.5%磷酸),室温放置10 min，545 nm比色，根据直线回归方程计算出NO含量。
1.5 肺M肿瘤杀伤活性测定 在培养板内加入肺M悬液 100 μl/孔，实验组再加入2 mmol/L NG单甲基左旋精氨酸（L-NMMA，Sigma公司），50 μl/孔，置37℃，5% CO2培养箱培养 4 h，再加入含10% P815上清液的营养液 100 μl/孔，置37℃,5％CO2培养72 h。每孔加二甲基亚砜(DMSO) 100 μl,混匀静置20 min,在PG-3022酶联仪上用570 nm波长测定D值,计算肿瘤细胞生长抑制率。
1.6 统计学处理 所有数据采用X±s表示，组间显著性检验用配对资料t检验，各指标进行直线相关分析。
2 结果
2.1 不同剂量INFγ对肺M产生NO的影响 不同剂量的 INFγ与活化的肺M共同培养24 h后,培养液中NO含量随着INFγ剂量的增加而升高(图1),且呈明显的剂量依赖关系(r=0.985,t=19.89,P＜0.01)。
图1 INFγ对肺巨噬细胞NO产生和iNOS活性的影响
fig 1 The effect of INFγ on NO production and
activity of iNOS by macrophages
●: NO; ▲: iNOS
2.2 INFγ对肺M NOS活性的影响 不同剂量INFγ作用于肺M后，肺M iNOS活性随INFγ剂量的增加而升高（图1）,与INFγ的剂量有明显的相关性(r=0.990, t=19.78，P＜0.01)。