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摘 要: 目的 观察猪主动脉瓣叶去细胞后的组织学和理化性能变化，探讨其作为未来“杂种”瓣膜支架的可能性．方法 新鲜采集的猪主动脉瓣叶经表面活性剂、核酸酶、渗透压变化作用，去除瓣叶组织的细胞成分，在光镜、电镜下观察组织学变化，测定瓣叶组织的含水量、可溶性蛋白含量、热皱缩温度、瓣叶厚度、描计了应力应变曲线．结果 成功地去除了猪主动脉瓣组织中的细胞成分；瓣叶去细胞后组织含水量明显增高［φ(94.6±0.3)％ vs (91.2±2.0)%，P＜0.01］，可溶性蛋白含量明显降低［ω(0.041±0.008)％ vs (0.056±0.006)%，P＜0.05］；热皱缩温度［(72.0±0.7)℃ vs (71.2±0.8)℃，P＞0.05］，瓣叶厚度［(0.8±0.3) mm vs (0.7±0.3) mm，P＞0.05］，断裂强度［(646±133) g·mm-2 vs (650±105) g·mm-2， P＞0.05］和断裂伸长率［(57±14)% vs (65±18)%，P＞0.05］均无明显差别．结论 采用表面活性剂、核酸酶结合渗透压变化的方法，能够成功地去除猪主动脉瓣组织的细胞成分，且不影响组织的理化性能，有可能作为纤维支架，用于构建“杂种”生物瓣膜．
引言
大量研究表明，异种生物瓣钙化与瓣膜中的细胞成分关系密切．我们将瓣膜组织中细胞成分去除，研究了其组织学变化，测定了力学强度，探讨其能否作为组织工程瓣膜的异种纤维支架，取得了初步的实验结果．
1 材料和方法
1.1 材料 ①新鲜猪主动脉瓣与4℃ hanks液中带回实验室，洗尽血液，轻轻擦去内皮，作为新鲜瓣(F组, n=25)． ②去细胞瓣叶的制备［1,2］：瓣叶于10 mL·L-1 triton X-100 0.01 mol·L-1 Tris缓冲液中(20 mL+PMSF 100μL/片)，4℃下持续振荡24 h；转入10 mL·L-1 triton X-100 1.5 mol·L-1 KCl溶液，同样作用24 h；0.01 mol·L-1 Tris Cl溶液充分洗涤(20 mL/片，振荡洗涤10 min×6次)；转入100 mL DNA酶、RNA酶工作液中，加DNA酶2 mL，RNA酶100μL ，37℃水浴过夜；转入低渗Triton X-100液中，4℃振荡24 h，充分洗涤．为去细胞瓣(aF组 n=25) ．
1.2 方法 新鲜瓣叶去细胞前后分别测定瓣叶可溶性蛋白含量、含水量、热皱缩温度、断裂强度、断裂伸长率．标本经固定后常规制作电镜、光镜标本，观察组织结构．
统计学分析：结果以X±s表示，采用t检验对所有数据进行统计学分析．
2 结果
瓣叶去细胞后组织含水量明显增高［φ(94.6±0.3)％ vs (91.2±2.0)%，P＜0.01］，可溶性蛋白含量明显降低［ω(0.041±0.008)％ vs (0.056±0.006)%，P＜0.05］；热皱缩温度［(72.0±0.7)℃ vs (71.2±0.8)℃，P＞0.05］，瓣叶厚度［(0.8±0.3) mm vs (0.7±0.3) mm，P＞0.05］，断裂强度［(646±133) g·mm-2 vs (650±104) g·mm-2，P＞0.05］和断裂伸长率［(57±14)% vs (65±18)%，P＞0.05］均无明显差别．
新鲜瓣(F组)瓣叶组织常规病理切片，HE染色，光镜下观察，见瓣叶表面内皮细胞绝大部分已被擦去，纤维层、松质层、室层三层结构完整，纤维细胞无自溶现象，纤维结构无损伤（Fig1a）．扫描电镜下，见表面无细胞成分残留，暴露出粗大的纤维，比较紊乱，深层纤维仍呈波浪状结构（Fig2a）．去细胞(aF组)瓣叶经常规切片染色，光镜下观察，见瓣叶组织中细胞成分完全消失，纤维层、松质层、室层三层结构在失去细胞后，单凭纤维网架亦可清晰辩认，纤维网之间的空白区，应该是原先纤维细胞占据的位置（Fig1b）；扫描电镜下见表面没有任何细胞成分残留，波浪状结构保存完好，排列规则，连极细小的纤维都能保存（Fig2b）；透射电镜下见交错排列的胶原纤维的纵剖面和横断面，纤维横纹清晰，结构无破坏（Fig3a,3b）．
图1 瓣叶组织光学显微镜观察
fig 1 The valve tissue under light microscope HE×20
a: Fresh valve; b: Acellular valve.
图2 瓣叶组织扫描电镜观察