点击显示 收起
松果体、中枢核团与淋巴细胞间信息传递的昼夜节律△
中国神经免疫学和神经病学杂志 1999年第1期第6卷 论 著
作者：童建 秦立强 朱金华
单位：童建 秦立强 朱金华 苏州医学院预防医学系，苏州 215007
关键词: 松果体；视交叉上核；中缝背核；淋巴细胞；信息传递
摘要 目的 探讨松果体、中枢核团视交叉上核(SCN)和中缝背核(DR)与外周淋巴细胞之间昼夜节律的联系和传递关系。方法 在标准的光照条件下，测定中枢和外周第一信使褪黑素(MT)、第二信使cAMP和cGMP的昼夜节律。结果 在小鼠松果体和血清中，MT含量的昼夜节律峰值位于黑暗中期，而各组织中cAMP/cGMP比值的节律峰值却位于光照中期，呈现相互倒置的位相关系。各组织中cAMP/cGMP比值的昼夜节律的峰值分别为：松果体，-155.82°(CT10∶23)；SCN，-166.30°(CT10∶54)；DR，-179.16°(CT11∶56)；血清，-186.66°(CT12∶27)；淋巴细胞，-188.00°(CT12∶32)。结论 依据cAMP/cGMP峰值出现的昼夜时间先后，由中枢向外周淋巴细胞的信息传递按照松果体→SCN→DR→血液→淋巴细胞的顺序进行。
中图号 Q426
Circadian Rhythms of Signal Transduction between Pineal, Central Nuclei and Lymphocyte
Tong Jian Qin Liqiang Zhu Jinhua
(Department of Preventive Medicine, Suzhou Medical College, Suzhou 215007)
Objective To explore the transductive relationship between pineal, central nuclei of suprachiasmatic nucleus (SCN) and dorsal raphe(DR), and peripheral lymphocyte in terms of circadian rhythm.Methods Circadian changes of melatonin (MT), cAMP and cGMP contents in the central nuclei and lymphocytes of mice were determined under the standard light-dark cycle.Results The peak of MT rhythm in pineal and serum was found at middle of the dark phase, and that of the cAMP/cGMP ratio in each tissue examed was presented at middle of the light phase, that is: pineal, -155.82°(CT10∶23);SCN, -166.30°(CT10∶54);DR,-179.16°(CT11∶56)；serum, -186.66°(CT12∶27)；and lymphocyte, -188.00°(CT12∶32),respectively. The peaks of MT and the cAMP/cGMP ratio showed an inverse phase relationship.Conclusion The sequence of the signal transduction betweem the central nuclei and the peripheral lymphocytes could be traced from pineal to SCN, then to DR and serum, and finally to lymphocytes, according to the timepoints at which the peak phase of the cAMP/cGMP rhythms appeared in a circadian day.
Key words pineal; central nuclei of suprachiasmatic nucleus; dorsal raphe; lymphocyte; signal transduction; circadian rhythm
生物节律的产生和控制，已知与松果体和某些中枢核团(视交叉上核、中缝背核等)密切相关。松果体合成和分泌的褪黑素(melatonin, MT)具有昼夜节律性，其变化与环境中光照信号的周期性变化是同步的。MT的主要功能曾被认为是传递光照与黑暗的周期性信号，但近年来发现它对神经内分泌和免疫系统的功能具有明显的调节作用［1］。
90年代以来，对免疫系统和神经内分泌系统之间的关系有较多的研究，证实免疫系统不仅受神经内分泌系统控制，同时也具有反相调节作用。这方面的研究已经发展成为一门新的边缘学科，即神经免疫内分泌学［2］。目前在此领域内的主要进展之一，是中枢系统与外周免疫间的调节及其信号传递。
为了了解在松果体(PN)、中枢核团视交叉上核(SCN)和中缝背核(DR)与外周免疫细胞之间昼夜节律信息的联系和传递关系，本研究以第一信使MT、第二信使环-磷酸腺苷(cyclic AMP, cAMP)和环-磷酸鸟苷(cyclic GMP, cGMP)为指标，对小鼠中枢核团和外周淋巴细胞信使的昼夜节律进行了测定与分析。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和材料 MT(Sigma公司)和GC-MS衍生化试剂PFPA(Aldrich公司)。其余大部分试剂购自上海试剂公司。昆明种小鼠由本院实验动物中心提供。
1.2 实验动物分组 雄性小鼠体重18～22g，随机分为12个组，每组10只。为了使环境信号对动物的影响标准化，正式实验开始之前，先使小鼠在稳定的人工光照周期(6∶00到18∶00光照，18∶00到6∶00黑暗，光强度250～350 Lx)和室温［(20±3)℃］下喂养2周，自由活动进食。
1.3 样品采集与处理 采样在一天中的6个时点，即4∶00、8∶00、12∶00、16∶00、20∶00和24∶00时进行，连续2天(d)。在每一个时点，分别对一组动物断头处死，于冰上迅速取出松果体，在0.2mol/L高氯酸溶液中超声粉碎，3000g离心10min，上清液经二氯甲烷振荡后6000g离心15min，将有机相以氮气吹干。血清样品处理相似，用于MT测定。为了测定cAMP和cGMP，将松果体、DR和SCN经分区定位取出，置于4℃缓冲液内，匀浆待测。同时取外周血1 mL，以密度梯度离心法分离淋巴细胞，并通过尼龙纤维柱分离出T淋巴细胞［3］。用台盼蓝清除试验测定T淋巴细胞存活率(大于95%)，显微镜下计数细胞并将细胞数调整到1×107个/mL。
1.4 MT测定 在经处理过的样品中分别加入50μL乙酸乙酯和PFPA后振荡10s，60℃反应45min，冷却并氮气吹干。MT测定采用气相色谱-质谱联检(GC-MS)分析［4］。仪器为GC8000气相色谱-质谱仪(MD800 Masslab Finnigan, USA)。进样前样品溶于20μL的异辛烷，取3μL以不分流进样，柱前压50kPa，进样温度240℃。载气He的流速为50cm/s。
1.5 cAMP和cGMP测定 采用放射免疫测定法［5］。所用cAMP和cGMP放免分析药盒由上海中医药大学同位素室提供。cAMP和cGMP的提取和测定程序按药盒说明书进行。样品经FJ-2008自动γ免疫计数器(西安核仪器厂)测每分钟计数值后，结果以每毫克核团组织或1×106个淋巴细胞中cAMP和cGMP的pmol量表示。
以上测定均持续进行2个昼夜周期。
1.6 统计分析 测定结果均以均数±标准误表示。对于一组不同时点的测定值，通过振幅检验(F检验)确定是否存在昼夜节律，并对节律用余弦方程进行拟合［6］：
F(t)=M+ACos(ωt+φ)
式中M为中值，即涨落变化的中线；A为节律振荡的振幅，表示上下波动的幅度；ω为角速度(360°/24 h)；φ为峰值相位，即振荡到达顶峰的时刻。按照余弦方程可绘出相应的余弦曲线。
2 结果
2.1 松果体和血清中MT含量的昼夜节律 图1示，小鼠松果体和血清中MT浓度一昼夜的变化规律。在黑暗中期(24∶00左右)，松果体和血清中MT浓度达到峰值，其中松果体峰值质量分数为(594.37±75.72) pg/mg，血清质量浓度(峰值)为(117.85±52.37) ng/L。二者节律时相的变化基本一致。
图1 小鼠松果体和血清中MT浓度昼夜变化
Fig 1 Circadian changes of MT in the pineal and serum of mice
2.2 松果体、DR和SCN细胞内cAMP和cGMP含量的昼夜节律 对昼夜测定结果经余弦法分析处理后，得到下列节律参数(附表)。
附表 各核团组织中cAMP和cGMP含量的昼夜节律参数
Table Parameters of circadian rhythms of cAMP and cGMP in nuclei
| Mesor | Amplitude | Acrophase | Peak time | |
| cAMP | ||||
| Pineal | 325.12 | 69.57 | -188.66 | 12∶35 |
| SCN | 251.16 | 43.28 | -209.34 | 13∶57 |
| DR | 200.40 | 79.81 | -50.43 | 3∶22 |
| cGMP | ||||
| Pineal | 176.41 | 84.13 | -16.28 | 1∶54 |
| SCN | 54.91 | 6.56 | -101.36 | 6∶48 |
| DR | 123.46 | 40.49 | -240.90 | 16∶04 |
2.3 淋巴细胞和血清中cAMP和cGMP含量的昼夜节律 对昼夜测定结果经余弦法分析处理后，得到下列拟合的余弦方程：
Y(淋巴细胞，cAMP)=3.90+2.20Cos(ωt-185.20)
Y(血清，cAMP)=2.09+0.27Cos(ωt-312.74)
Y(淋巴细胞，cGMP)=1.25+0.53Cos(ωt-18.30)
Y(血清,cGMP)=1.62+0.43Cos(ωt-160.78)
2.4 中枢核团与淋巴细胞中cAMP和cGMP比值的昼夜节律 将昼夜各时点cAMP和cGMP的测定值相除，分别得到SCN、DR、松果体以及血清和淋巴细胞的cAMP/cGMP比值余弦曲线(图2，3)。
图2 SCN、DR和松果体cAMP/cGMP比值的昼夜节律
Fig 2 Circadian rhythms of cAMP/cGMP ratio in SCN, DR and pineal
图3 淋巴细胞和血清cAMP/cGMP比值的昼夜节律
Fig 3 Circadian rhythms of cAMP/cGMP ratio in lymphocyte and serum
3 讨论
cAMP和cGMP是一对具有双向调节功能的细胞信使，曾有人以“阴阳学说”描述其相互拮抗和制约的生物调节作用［7］。在大多数组织细胞中，cAMP与cGMP的峰值和谷值相呈现相互倒置的关系，即cAMP的峰值相对应于cGMP的谷值相，反之亦然。如BALB/c小鼠血浆中cAMP和cGMP的昼夜含量即表现为倒置位相［8］。由于cAMP和cGMP的功能和细胞中的浓度节律具有相反的位相关系，如果单独比较不仅难以分析，而且无法观察其双向调节的净效应。为此，采用二者的比值，即cAMP/cGMP来描述其昼夜节律的变化更为合理。
本次研究的测定结果显示，各组织中cAMP/cGMP比值的昼夜节律的峰值分别为：松果体，-155.82°(CT10∶23)；SCN，-166.30°(CT10∶54)；DR，-179.16°(CT11∶56)；血清，-186.66°(CT12∶27)；淋巴细胞，-188.00°(CT12∶32)。从峰值位相出现的时间顺序的角度可以看出，由中枢向外周免疫细胞的昼夜信息传递是按松果体→SCN→DR→血液→淋巴细胞的次序进行的。对此，还需其他的试验加以证实。
与此相对应，第一信使MT的信息传递方向也是从松果体→血液。不同的是，其昼夜峰值位相在黑暗中期，谷值在光照中期，与cAMP/cGMP比值的节律位相正好相反。MT被认为是主要的时间生物学激素［9］，它可通过其淋巴细胞上的MT1受体，抑制G蛋白偶联并下调腺苷酸环化酶，从而降低胞内cAMP的浓度。另一方面，MT又可刺激外周血淋巴细胞产生cGMP，因而总的结果是使cAMP/cGMP的比值下降。一般认为，淋巴细胞内cAMP/cGMP比值的变化反映了这一对环核苷酸的功能状态。当比值下降时，具有促进免疫细胞增殖、增加抗体形成和细胞毒活性，从而上调免疫功能的作用。反之，在比值升高时，能抑制细胞分裂和相应的免疫功能，因而对免疫反应起负调节作用。
近年来在对神经免疫调节的研究中，已经提出免疫神经递质是神经内分泌和免疫系统之间的重要桥梁物质。然而，从细胞信使昼夜节律传导的角度探讨中枢核团与免疫细胞间联系的研究，文献中尚未查见。本实验结果显示的MT与cAMP/cGMP间的位相性关系，提示二者在介导中枢与外周免疫节律信息的传递过程中，可能起着重要的联系作用。
△国家自然科学基金(39770246)资助
参考文献
1 Morrey KM, McLachlan JA, Serkin CD, et al. Activation of human monocytes by the pineal melatonin. J Immunol, 1994, 153(6):2671-2680
2 Wilder RL. Neuroendocrine-immune system interactions and autoimmunity. Annu Rev Immunol, 1995, 13:307-338
3 薛 彬.免疫毒理学实验技术.北京：北京医科大学 中国协和医科大学联合出版社，1995.7-12
4 Pang SF, Tsang CW, Hong GX, et al. Fluctuation of blood melatonin concentration with age: result of changes in pineal melatonin secretion, body growth and aging. J Pineal Research, 1990, 8:179-192
5 Tong J, Edmunds LN. Role of cyclic GMP in the mediation of circadian rhythmicity of the adenylate cyclase-cyclic AMP-phosphodiesterase system in Euglena. Biochem Pharmacol, 1993, 45(10):2087-2091
6 童 建.余弦分析法在生理节律研究中的应用.中国卫生统计，1991，8(1)：23-25
7 Edmunds LN. The role of ions and second messengers in circadian clock function. Chronobiol Int, 1992, 9(3):180-200
8 张彭三.不同时辰电针大鼠足三里穴对血浆中cAMP和cGMP含量的影响.徐州医学院学报，1994，14(2)：95-97
9 崔允文.时间生物学.北京：北京科学技术出版社，1996.265-267
(1998-03-16收稿)