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多发性硬化与髓鞘抗体及髓鞘碱性蛋白
中国神经免疫学和神经病学杂志 1999年第1期第6卷 论 著
作者：丁美萍 闻树群
单位：丁美萍 浙江医科大学附属二院神经内科，杭州310009；闻树群 浙江医科大学附属二院临床神经病学实验室
关键词: 多发性硬化；抗体；髓鞘碱性蛋白；酶联免疫吸附测定
摘要 目的 探讨多发性硬化的免疫发病机制。方法 采用ELISA方法测定多发性硬化患者活动期血清(28例)和脑脊液(18例)的GM1抗体、脑磷脂抗体和髓鞘碱性蛋白。结果 多发性硬化患者血清GM1抗体阳性率为36%，脑磷脂抗体为43%；脑脊液GM1抗体为11%，脑磷脂抗体为18%，与对照组比较差异均有显著性；血清和脑脊液的髓鞘碱性蛋白增高亦有意义。结论 体液免疫参与了多发性硬化的发病过程。可能的机制是，针对自身组织的髓鞘蛋白、髓鞘脂质等自身免疫系统被激活，产生一系列病理改变和临床症状。
中图号 R744.5
A Study of Anti-myelin Antibody and Myelin Basic Protein in Serum and Cerebrospinal Fluid in Patients with Multiple Sclerosis
Ding Meiping Wen Shuqun
(Department of Neurology,The 2nd Affiliated Hosiptal of Zhejiang Medical University,Hangzhou 310009 )
Objective In order to understand the role of the immune function in the pathogenetic mechanism of multiple sclerosis (MS).Method Antigangliosides GM1 antibody and cephalin antibody in serum (n=28) and cerebrospinal fluid (n=18) were examind in MS patients with ELISA assay.Results We found GM1 antibody in 36% and cephalin antibody in 43% of MS patients in serum,GM1 antibody in 11% and cephalin antibody 18% in cerebrospinal fluid.The levels of antibody in serum of treated_MS patients were significantly lower than those in active MS patients.The levels of myelin basic protein in serum and cerebrospinal fluid in MS were significantly higher than those in control group.Conclusion The presence of antibody to myelin in MS patients is elevated.The humoral immunity might paly a role in the pathogenetic mechanism of MS.
Key words multiple sclerosis;antibodies;ELISA;myelin basic protein
多发性硬化(MS)的病因尚不完全清楚，但其自身免疫的发病机制已得到证实和公认，属于特异性抗原介导的细胞免疫和体液免疫共同参与的中枢神经系统炎性脱髓鞘病。神经节苷脂(ganglioside)、脑磷脂(cephalin)是髓鞘脂类的主要成分，近年来国外文献报道了髓鞘抗体与神经系统免疫性疾病的关系。为了探讨脂质抗体在MS中的作用，检测了MS患者血清和脑脊液中的GM1抗体、脑磷脂抗体和髓鞘碱性蛋白(MBP)，意欲进一步揭示MS的免疫机制。
1 资料和方法
1.1 临床资料
1.1.1 病例组：MS患者来自1995～1996年本科住院患者，符合Poser等［1］1983年修订的诊断标准。共28例(男性16例，女性12例)，年龄14～52岁［(29±11)岁］，病程1～24月，平均(6.2±4.3)月。主要表现为：(1)颅神经损害：视力障碍16例，其中2例视神经萎缩；眼肌麻痹10例；吞咽困难2例。(2)运动障碍：不全四肢瘫8例，截瘫5例，偏瘫2例，共济失调11例。(3)反射改变：腱反射亢进12例。(4)感觉障碍11例。(5)诱发电位：视诱发电位P100延长24例，脑干诱发电位异常21例，主要表现为Ⅲ-Ⅴ、Ⅰ-Ⅲ峰间潜伏期延长。(6)MR：23例患者侧脑室旁有多个斑块状长T2信号。收集MS患者活动期的28例血清和18例脑脊液，贮于-40℃待检。
1.1.2 对照组：40例血清来自正常健康的献血员，20例脑脊液来自外科手术作腰麻者(无神经系统疾病)，其年龄、性别与病例组相匹配。
1.2 方法 采用酶联免疫法吸附测定，方法灵敏稳定，重复性好。
1.2.1 GM1抗体和脑磷脂抗体测定：GM1和脑磷脂均为Sigma产品，分别以无水乙酸溶解，加入酶标反应板，0.05 mL/孔(GM1抗体为0.35 μg或脑磷脂抗体0.7 μg)，迅速冷风吹干，每孔加2%(体积分数)BSA-PBS置冰箱过夜，后用pH7.4 PBS 洗3次，每次5 min。每孔加1∶100稀释血清0.1 mL(脑脊液不稀释)，37℃ 1 h,同上法洗3次。加1∶3000兔抗人IgG、IgM(Doko产品)37℃ 1 h,PBS洗3次。加底物邻苯乙胺(Sigma产品)，37℃避光15 min,在318-MC酶标仪上测光密度，以不加血清孔作空白，以大于或等于正常对照组平均值的2.1倍者为阳性。
1.2.2 MBP测定：稀释抗血清每孔0.2 mL 包被于酶标板4℃过夜，用pH7.4 PBS洗涤5次，每次5 min，加1%(体积分数)BSA 碳酸基缓冲液0.2 mL封闭各孔，37℃ 1 h，同上法洗涤后加血清(或者脑脊液)0.2 mL。同时加MBP标准每孔0.2 mL,37℃ 1 h,同前洗涤。加酶标抗体0.2 mL，37℃ 2 h后再洗涤。加底物(MTB)每孔0.2 mL,37℃ 20 min,在酶标仪318-MC上波长630 nm比色，参照标准曲线计算出各标本的MBP含量。
1.2.3 数据处理：采用χ2和t检验进行统计。
2 结果
2.1 血清和脑脊液GM1抗体检测 28例MS患者的血清检查示，10例(36%)GM1抗体阳性，显著高于对照组(χ2=6.890，P＜0.01)，其中6例为GM1-IgG抗体阳性，4例为GM1-IgM抗体阳性，1例患者IgG、IgM抗体均为阳性。18例MS患者的脑脊液检查示，4例(22%)抗体阳性，与对照组比较差异亦有显著性(χ2=4.97,P＜0.05)。
2.2 血清和脑脊液脑磷脂抗体检测 28例MS患者血清检查示，12例(43%)脑磷脂抗体阳性，与对照组比较，其阳性率明显增高(χ2=7.24,P＜0.01)，其中7例为IgG抗体阳性，5例为IgM抗体阳性，2例患者IgG、IgM抗体均为阳性。6例患者，血清GM1抗体和脑磷脂抗体均为阳性。18例MS患者的脑脊液检查示，5例(28%)抗体阳性，与对照组比较，其阳性率亦明显增高(χ2=6.40,P＜0.05)。
2.3 血清和脑脊液的髓基碱性蛋白的测定 28例MS患者血清MBP为(4.69±0.89) ng/mL，与对照组比较有显著差异(t=3.741,P＜0.001)；18例患者的脑脊液MBP为(2.03±0.56) ng/mL,与对照组比较亦有意义(t=3.195,P＜0.005)。
2.4 抗体的动态观察 对22例MS患者在激素治疗1个月后其临床症状改善时复查血清髓鞘抗体，GM1抗体和脑磷脂抗体各2例阳性，与治疗前比较两抗体下降差异有显著性(分别为χ2=3.830，P＜0.05；χ2=5.574,P＜0.05)。说明抗体水平与疾病进展有关。
3 讨论
髓鞘的固体成分30%为蛋白质，70%为脂质，脂类的抗原性较弱，主要为磷脂类、脑苷脂和磷脂，还有神经节苷脂；髓鞘蛋白的主要成分为MBP，具有较强的抗原性，MBP抗体为保护性抗体。动物接种MBP或神经节苷脂所引起的实验性变态反应性脑脊髓炎，其临床和病理特性与MS相似，是MS理想的动物模型。
本研究观察到，MS患者活动期血清有关抗体阳性率为：GM1抗体36%，脑磷脂抗体43%，脑脊液GM1抗体11%，脑磷脂抗体18%，与对照组比较差异均有显著性，说明髓鞘脂质抗体参与了MS的发病过程［2，3］。Acarin等［4］测定了42例MS患者的多种神经节苷脂抗体，20例(40%)有一种或多种抗体阳性，其中asialo-GM1抗体阳性占20%，GM1抗体阳性占38%，GD1D抗体阳性占33%。这些抗体主要为IgG抗体(50%)，IgM抗体为35%。脂质的抗原性较弱，内源性神经节苷脂与细胞识别、细胞粘附、细胞分化和神经再生有关，外源性神经节苷脂通过直接结合IL-2和封闭相关细胞表面受体，抑制T细胞增殖。神经节苷脂和脑磷脂可增强MBP的致病作用，在实验性变态反应性脑脊髓炎的模型中，神经节苷脂和脑磷脂加MBP组致病率高于单独神经节苷脂和脑磷脂组或MBP组。
治疗后的MS患者血清抗体阳性率明显下降，说明抗体水平变化与病情缓解、应用激素有关［5］，这也提示髓鞘脂质抗体在MS发病中可能有作用。
MBP在髓鞘形成中起重要作用，并维持了中枢神经系统髓鞘结构和功能的稳定。血清和脑脊液MBP测定可反映中枢神经系统有无实质性损害，特别是有无髓鞘脱失的一个较为特异性的生化指标，其含量的高低一定程度上反映了损害的范围和严重程度［5］。本研究结果与文献报道一致，在MS患者的活动期，血清和脑脊液中MBP明显增高，表明了MS患者存在髓鞘的脱失和损害。Barkhof等报道，MS患者急性期脑脊液MBP与临床评分及MR增强病灶体积间有显著相关关系，提出脑脊液MBP监测对判断MS预后、病情严重程度和临床诊断很有意义［5］。MS患者由于免疫功能的异常，使MBP具有自身抗原性，引起T淋巴细胞致敏活化［6，7］和B细胞克隆扩增、表达效应功能，产生了MBP抗体［8，9］。致敏的T细胞反应对髓鞘有很大的破坏作用，故认为MBP的特异性自身抗原，在MS的发病机制中起关键作用［10］。
总之，MS的可能发病机制是，由于感染或应激情况下，针对自身组分的MBP、神经节苷脂等自身免疫系统被激活［11，12］，体液免疫和细胞免疫共同参与的免疫系统应答过度，选择性地攻击中枢神经的白质，导致髓鞘的脱失，产生一系列相应的病理改变和临床症状。
参考文献
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(1998-03-13 收稿)