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人胚胎胸腺降黑素受体的鉴定及信息转导途径
中国神经免疫学和神经病学杂志 1999年第4期第6卷 论 著
作者：赵瑛 邵福源 彭树勋
单位：彭树勋 香港大学医学院生理系；赵瑛 邵福源 彭树勋（第二军医大学长征医院神经科，上海 200003）
关键词: 胸腺；免疫；降黑素受体
摘要 目的 为了证实人胚胎胸腺是否存在降黑素受体(MR)以及是否通过G蛋白介导的信息转导系统。方法 应用放射配体法测定中期引产人胎儿中枢性免疫器官——胸腺的MR。 结果 它们具有高亲和力，平衡解离常数为(9.1±1.9) pmol/L，低结合容量，蛋白的最大结合容量为(0.74±0.28) fmol/mg；动力学研究显示具可逆性及可饱和性；特异性研究表明对降黑素(M)及其激动剂具高度特异性，符合特异结合位点的全部条件，而G蛋白抑制剂(GTPrS)使［125I］M特异结合位点量明显降低。结论 人类免疫器官是M作用的靶器官，M对免疫系统的作用应该是直接的，MR属于G蛋白系统。
中图号 R322.53
Identification and Characteristic Melatonin Receptor in Human Embryo Thymus
Zhao Ying Shao Fuyuan Peng Shuxun（Department of Neurology,Chang Zheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200003）
Objective In order to verify the existing melatonin receptor in human embryo thymus and GTPrS effect on ［125I］ iodomelatonin binding in human embryo thymus. Methods Specific binding of melatonin to embryo thymus was measured by using radioligand binding assays. Results Results revealed the maximum binding capacity (Bmax) was(0.94±0.28)fmol/mg protein and equilibrium constant (Kd) was (39.1±4.9) pmol/L.GTPrS dose dependently inhibited the binding. Conclusions These data demonstrated that specific binding of melatonin was present in the human embryo thymus.GTPrS inhibited the binding indicated that these putative melatonin receptors had coupled to G-proteins.
Key words melatonin receptor;thymus;embryo
神经内分泌和免疫系统是互相联系的，免疫系统及它的产物可改变神经内分泌的功能，而神经内分泌信号也同样影响免疫功能。松果腺是神经内分泌系统中的成员之一，近年的研究表明松果腺分泌的激素——降黑素(Melatonoin,M)有免疫调节作用及抗肿瘤生长作用［1～3］。切除C57小鼠松果腺使鼠抗绵羊红细胞产生的体液免疫反应受到抑制并使免疫指标的昼夜节律发生紊乱；傍晚注射M可以逆转应激，逆转氢化考的松或环磷酰胺所致的免疫抑制；M尚可恢复T辅助细胞的活性及白介素Ⅱ生成，可刺激自然杀伤细胞的活性，但免疫调节及抗肿瘤生长的作用机制不明。吗啡受体拮抗剂可拮抗M的免疫调节作用，故有人推测是间接通过吗啡受体起作用［2］。我们先前的工作已证明鸟类及鼠类中枢性免疫器官及腔上囊上存在降黑素受体(MR)［4，5］，并推测人类免疫器官也存在MR，若证实这一点则可提示M对免疫的调节作用是通过免疫器官上的MR直接作用的结果。为此我们以中期引产人胎儿的中枢性免疫器官—胸腺为研究材料，以进一步证实上述推测。
1 材料和方法
1.1 检测对象 中期引产(胎龄4～7个月)人胎儿12例，其中男性7例，女性5例。
1.2 检测方法
1.2.1 膜蛋白提取：胎儿引出后，取出胸腺，立即用于实验或液氮速冻后贮存于-86℃超低温冰箱内保存。实验时将新鲜的或解冻的组织加10倍体积的Tris-HCl缓冲液(浓度0.05 mol/L，pH 7.45)进行匀浆。先离心(400 g，5 min)去除纤维及不溶解的物质，再离心(44 000 g，25 min)分离出膜蛋白，用Tris-HCl缓冲液洗涤1次，膜蛋白质量浓度为3～9 g/L，用Lowry法［6］测定蛋白质量浓度。亚细胞分布的研究：用Tris-HCl缓冲液(包含浓度0.32 mol/L的蔗糖)将胸腺匀浆，先离心(1 000 g，10 min)分离出粗制细胞核，再离心(27 000 g，10 min)分离出粗制线粒体，最后离心(100 000 g，10 min)分离出微粒体及胞浆。
1.2.2 胸腺［125I］M特异结合测定：应用放射配体结合法。总结合(TB)管加膜蛋白悬液100 μL、Tris-HCl缓冲液200 μL、［125I］降黑素(2-［125I］ iodomelatonin、［125I］M，美国Dupont公司产品，81.4 TBq/mmol、4～200 pmol/L中选12个浓度)50 μL，总体积为350 μL，非特异结合(NSB)管分别加膜蛋白悬液、Tris-HCl缓冲液、非标M(Sigma公司产品，终浓度10-6 mol/L)，以及［125I］M 50 μL，也为350 μL。37℃孵育60 min(除动力学外)，用4℃ Tris-HCl缓冲液中止反应，然后用多头细胞收集器，通过玻璃纤维滤膜(孔径1 μm，英国Whatman公司产品)真空负压抽吸进行清洗，最后用γ计数仪(Beckman公司产品)测定放射活性。TB-NSB即为特异结合(SB)。应用Ligand计算机方程，通过Scatchard分析计算出最大结合容量(Bmax)和平衡解离常数(Kd)。TB的计数为35.7～71.4 Bq，NSB占TB的1/3左右。
1.2.3 胸腺［125I］M特异结合动力学分析：向TB和NSB管中加［125I］M的浓度为100 pmol/L，于37℃孵育5、10、20、30、40、60、80、100及120 min后测定不同时间的［125I］M特异结合量(结合过程)。应用pseudo-first-order方程计算结合常数(K1)，于结合反应的第60 min加非标M(10-6 mol/L)，在加后5、10、20、30、40、60、80及100 min分别测定［125I］M特异结合解离数值，应用first-order方程计算解离常数(K-1)，并计算出平衡解离常数(Kd，即K-1/K1)。
1.2.4 ［125I］M特异结合的特异性分析：应用M、M激动剂或拮抗剂、其他M衍生物或作用于5-羟色胺能、肾上腺素能及乙酰胆碱能受体的激动剂，以7种浓度(10-12～10-4 mol/L)作用于MR，研究各化合物对M特异结合的取代率，应用计算机程序计算出替代率达50%时的浓度(IC50)，根据IC50比较各化合物对MR的亲和力。［125I］M的浓度均为100 pmol/L。
1.2.5 G蛋白结合抑制剂(GTPrS)对胸腺［125I］M特异结合的影响：应用GTPrS 10和50 μmol/L，观察加入GTPrS后［125I］M特异结合的Bmax和Kd的改变，以明确胎儿胸腺MR的信息转导是否通过G蛋白介导。
2 结果
2.1 胎儿胸腺［125I］M特异结合饱和分析 6例胎儿胸腺［125I］M特异结合Scatchard分析，蛋白的Bmax为(0.94±0.28) fmol/mg(范围0.54～1.48)，Kd值为(39.1±4.9) pmol/L(范围4.9～58.6)(图1，2)。从图1可见MR的SB为可饱和性，图2可见回归线为一直线，Hill系数0.96±0.08。
图1 胎儿胸腺［125I］M特异结合饱和曲线
fig 1 Saturation curve of ［125I］ iodomelatonin binding to human embryo thymus membraine 1.TB；2.SB；3.NSB
图2 胎儿胸腺［125I］M特异结合Scatchard分析
fig 2 Scatchard analysis of specific binding of 2-［125I］ iodomelatonin to human embryo thymus
2.2 胎儿胸腺［125I］M特异结合动力学分析 胎儿胸腺［125I］M特异结合动力学分析各3次实验结果，K1为(7.83±1.8)×107 mol/(L·min)，K-1为(2.9±0.5)×10-3 /min(图3)，Kd值(37.03±4.5)pmol/L与饱和分析测得的Kd值十分近似。
图3 胎儿胸腺［125I］M特异结合动力学过程
fig 3 Kinetic-course of 2-［125I］ iodomelatonin binding to human embryo thymus 1.Association；2.Dissociation
2.3 激素结合的特异性分析 12种化合物对［125I］M特异结合取代率的IC50见表1。从表中可见该结合位点对各化合物的亲和力高低排列为：2碘降黑素＞降黑素＞6-氯降黑素＞6-羟降黑素＞N-乙酰血清素＞5-羟色胺＞色胺、5-乙酰吲哚、L-色氨酸＞去甲肾上腺素、肾上腺素、乙酰胆碱。
表1 胎儿胸腺［125I］M特异结合特异性分析
Table 1 Specific analysis of 2-［125I］iodomelatonin
binding to human embryo thymus membrane preparations
| Compound | IC50 (nmol/L) |
| 2-iodomelatonin | 2.8±0.7 |
| Melatonin | 9.1±1.2 |
| 6-chloromelatonin | 12.4±3.8 |
| 6-hydroxymelatonin | 24.3±5.6 |
| N-acetylserotonin | 438.6±12.5 |
| 5-hydroxytryptamine | 891.5±128.3 |
| Tryptamine | ＞104 |
| 5-acetylindole | ＞104 |
| L-tryptophan | ＞104 |
| Norepinephrine | ＞104 |
| Epinephrine | ＞104 |
| Acetylcholine | ＞104 |
2.4 胎儿胸腺［125I］M特异结合亚细胞分布 胎儿胸腺各亚细胞组分［125I］M特异结合量测定结果见表2。3次实验结果一致，细胞核MR含量最高，线粒体次之。
表2 胎儿胸腺［125I］M特异结合亚细胞分布(
Table 2 Subcellular distribution of specific 2-［125I］ iodomelatonin
binding to human embryo thymus membrane preparation
| Fraction | Specific binding of protein/fmol·mg-1 | Total specific binding(%) |
| Nuclear | 0.77±0.18 | 38.8±4.0 |
| Mitochondrial | 0.67±0.11 | 33.9±5.6 |
| Microsomal | 0.31±0.06 | 15.7±3.0 |
| Cytosol | 0.23±0.02 | 11.6±1.0 |
2.5 GTPrS对胸腺［125I］M特异结合的影响 实验结果表明，加入GTPrS后胎儿胸腺［125I］M特异结合明显降低(P＜0.01)，并有剂量依赖性(图4)，即浓度为50 μmol/L GTPrS的抑制作用明显大于浓度为10 μmol/L者，差异有显著性(P＜0.01)。
图 4 GTPrS对胎儿胸腺［125I］M特异结合的影响
fig 4 The effects of GTPrS on ［125I］M specific binding in human embryo thymus
1.Control;2.10 μmol/L GTPrS;3.50 μmol/L GTPrS
3 讨论 本研究证明人胎儿中枢性免疫器官——胸腺存在［125I］M特异结合位点。这些结合位点具以下特点：(1) 高亲和力［Kd为(9.1±1.9) pmol/L］；(2) 低结合容量［蛋白的Bmax为(0.74±0.28) fmol/mg］；(3) 动力学分析显示具有可饱和性及可逆性，符合受体结合及解离过程；(4) 具激素结合特异性：对M及MR激动剂具高度特异性，对其他M衍生物及5羟色胺能、肾上腺素能、乙酰胆碱能受体激动剂则几乎无亲和力。以上几点可以满足特异结合位点的全部条件。Scatchard分析的回归线(图2)为一直线，Hill系数近于1，表明该结合位点为单一高亲和力位点。
胎儿胸腺［125I］M特异结合亚细胞分布的研究结果与先前小鼠胸腺MR的结果一致［4］，以细胞核含量最高，线粒体次之，该结果与鸭的胃肠道及鸟类腔上囊得到的结果一致［7，8］。但仓鼠脑及鸟类脑组织测定的结果则是以线粒体含量最高，细胞核次之［9，10］，这种差异可能与组织不同种属差异或使用方法不同有关。此外密度梯度离心法得到的各亚细胞组分均为粗制成分，各亚细胞组分间相互掺杂也属难免。细胞核含量最高，提示M除作用于细胞膜以外，尚可通过内化(internatively)进入细胞内，继而进入细胞核，调节基因表达及蛋白合成过程。
加入GTPrS后胸腺［125I］M特异结合的Bmax明显降低，浓度为50 μmol/L者作用大于10 μmol/L者，表明具剂量依赖性。该结果提示胸腺降黑素受体的信息转导属于G蛋白系统。G蛋白分为多个种类，其中主要为刺激性G蛋白(Gs)和抑制性G蛋白(Gi)二类；GTPrS主要抑制Gi系统，表明MR通过Gi系统进行信息转导。
总之，我们的工作表明人类胸腺存在MR，结合我们先前工作，鸟、鼠类胸腺及腔上囊存在MR，表明免疫器官是M作用的靶器官，M对免疫器官的调节是通过免疫组织上MR直接作用的结果。该项研究将为探索神经系统、内分泌系统对免疫系统的调节开辟新的领域。
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(1998-07-21 收稿)