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摘要：目的观察小鼠着床前的胚胎细胞中原癌基因ras编码的蛋白产物p21Ras及cerbB2的表达,并了解其对着床前的胚胎发育的可能作用。方法采用免疫组织化学ABC法，检测着床前小鼠胚胎中p21Ras及cerbB2蛋白的表达。结果小鼠着床前的胚胎细胞中p21Ras的免疫反应呈阳性,阳性物质分布于胞质中,胚胎外透明带呈阴性反应；而在各期着床前的胚胎中均未检测到cerbB2蛋白的表达。结论小鼠着床前的胚胎中，有原癌基因ras编码蛋白的表达,p21Ras是增殖和分化受体介导的信号传导途径中的重要组成部分，可能在小鼠着床前的胚胎发育过程中起重要的调节作用。CerbB2基因对于围着床期子宫的生长发育具有重要的作用；而在小鼠着床前的胚胎发育过程中似乎不起重要作用。
中图号:Q492.6 文献标识码：A 文章编号：1007－8738(2000)03－0271－03
Expressions of p21Ras and c erbB2 proteins in mouse
preimplantations embryos
LI Yan-hong YAO Yuan-qing YANG Meng-geng
（Department of Obstetrics and Gynaecology, Tangdu Hospital, Xi'an 710038）
YAO Bing HUANG Wei-quan
（Department of Histology and Embryology, Fouth Military Medical University， Xi’ an 710032, Shaanxi Province, China）
Abstract: Aim To investigate the expressions and possible role of p21Ras and c erbB2 proteins in preimplantation mouse embryos. Methods Detection of p21Ras and c erbB2 protein expressions by immunohistochemical ABC staining. Results Protein p21Ras was found in preimplantation mouse embryo from 4 cell stage to blastocyst stage. The positive staining substances were located in cytoplasm. Protein c erbB2 was not dectected in any stages of preimplantation mouse embryos. Conclusion Products of proto oncogene p21 ras present in mouse preimplantation embryos. It suggests that p21Ras may play a role in early embryo development. erbB2 proteins in preimplantation mouse embryos. Methods Detection of p21Ras and c erbB2 protein expressions by immunohistochemical ABC staining. Results Protein p21Ras was found in preimplantation mouse embryo from 4 cell stage to blastocyst stage. The positive staining substances were located in cytoplasm. Protein c erbB2 was not dectected in any stages of preimplantation mouse embryos. Conclusion Products of proto oncogene p21 ras present in mouse preimplantation embryos. It suggests that p21Ras may play a role in early embryo development.
Keywords: ras gene; c erbB2 gene; embryo; immunohisto;chemical staining ▲
从受精卵卵裂分化到形成成熟的个体，细胞中的某些原癌基因在某一特定的阶段处于一定的活化状。在生理情况下，它们的表达产物在细胞的生长、分化和信号转导等方面起着极为重要的作用。就目前的资料看来，绝大多数原癌基因的表达开始于胚胎时期，其中多数主要在胚胎中期开始表达。近年来，国外有人研究发现，在着床前的小鼠胚胎中，可检测到一些原癌基因的表达，这些原癌基因对于着床前胚胎的发育起着重要的作用〔1〕。ras基因的产物p21Ras是一种G蛋白，为酪氨酸激酶的下游分子，在酪氨酸激酶信号转导途径中发挥作用。有人在小鼠囊胚期曾检测到p21Ras的表达，但在更早期的胚胎细胞中未见有p21Ras表达的报道。c-erbB2基因表达于围着床期小鼠的子宫〔2〕，而在着床前的胚胎中是否有表达未见报道。我们从蛋白质水平，检测了这两种原癌基因在着床前小鼠胚胎中的表达，以探讨其在着床前的胚胎发育中起的作用。
1 材料和方法
1.1材料孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)，由宁波第二激素厂提供。兔抗p21Ras多克隆抗体为北京中山生物技术有限公司产品。抗c-erbB2单克隆抗体(mAb)及ABC试剂盒，均由武汉博士德生物工程有限公司提供。
1.2方法
1.2.1小鼠早期胚胎的获取选用本校动物中心提供的一级健康昆明种小白鼠，雌雄兼用，鼠龄8～10wk,体重(30±5)g,光照、黑暗各12h，自由摄食、饮水。于雌鼠腹腔注射10UPMSG，48h后再腹腔注射10UHCG促超排卵，当晚与雄鼠2∶1合笼。次日晨检查阴栓，按照Liu等〔3〕的方法，将有阴栓者分别于注射HCG后36，48，60和74h,颈椎脱臼法处死，在解剖显微镜下输卵管全段冲卵，收集2细胞、4细胞、8细胞及桑葚胚等不同时期着床前的胚胎。将卵裂球置于APES处理过的载玻片上，用Bouin's液固定24h。
1.2.2免疫组织化学ABC法将置有卵裂球的玻片用PBS洗涤3次;甲醇－双氧水处理30min,以抑制内源性过氧化物酶的活性。以PBS洗3次后，依次分别加入兔抗p21Ras多克隆抗体及抗cerbB2mAb(1∶100稀释),37℃孵育1h后转4℃过夜。二抗分别为生物素标记的羊抗兔和羊抗小鼠IgG(1∶200稀释，室温孵育1h)和ABC复合物(1∶100稀释，孵育30min以上。每个步骤之间均以PBS洗涤3次，每次5min。最后加DAB－双氧水显色15～20min,用水洗终止反应。置37℃温箱烘干后,二甲苯透明、封片。本实验中以生理盐水代替一抗作为空白对照，以正常兔血清代替一抗作阴性对照，用已知的p21ras和cerbB2阳性的肿瘤标本作为阳性对照。
2 结果
免疫组织化学染色的结果显示,p21Ras在小鼠着床前的胚胎中呈阳性表达(图略)，阳性细胞染呈深棕色、背底清晰,很易辨认。最早在4细胞期，即可观察到p21Ras表达阳性的细胞中,阳性物质分布于胞质；而在各期着床前的胚胎中均未检测到cerbB2的表达。
3 讨论
近年来,国外学者研究发现,着床前小鼠胚胎中,可检测到一些原癌基因的表达〔1〕。尽管大量研究证实,原癌基因在一系列已分化的细胞中均有表达并起作用，但它们对着床前胚胎发育的作用仍不清楚。
国外有人报道，在囊胚期的小鼠胚胎中可检测到ras基因的表达〔1,4〕。本研究中我们采用免疫组织化学方法，发现囊胚期以前的卵裂期胚胎中也有ras基因的表达，最早可见于4细胞期。p21Ras是相对分子质量(Mr)为21000的酪氨酸激酶的下游分子。在酪氨酸激酶信号转导途径中，p21Ras参与蛋白酪氨酸激酶生长因子受体的信号转导，是增殖和分化受体介导的信号转导途径中的重要组成部分。
虽然已明确体细胞的生长分化由多肽生长因子调节，而其在着床前胚胎发育中的作用目前仍不清楚。哺乳类胚胎在无血清及生长因子的化学培养基中能发育至囊胚期，可见外源性生长因子似乎不是着床前胚胎发育所必需的，而加入外源性生长因子则可起促进作用〔5,6〕。许多研究认为，胚胎可能产生生长因子(以自分泌方式)并对其发生反应。已发现许多生长因子及其受体在卵裂期胚胎中有表达〔7〕，许多生长因子受体(如胰岛素受体、胰岛素样生长因子－I和胰岛素样生长因子－Ⅱ受体)均是蛋白酪氨酸激酶，与生长因子结合后而激活。活化受体即发生磷酸化并激活细胞内一系列靶基因，导致信号由细胞表面传导至核内，最终引起基因表达的改变。p21Ras是G蛋白，其作用是将信号从蛋白酪氨酸激酶受体传导至细胞内下游分子：如促有丝分裂原活化蛋白、Raf丝氨酸/苏氨酸激酶、翻译因子eIF-4及磷脂酶C，从而促进细胞增生；也为细胞分化所需的。编码细胞内信号通路基本元件的这一原癌基因在小鼠着床前的胚胎中就有表达。由于这些胚胎也表达蛋白酪氨酸受体，因此，其拥有对多肽生长因子发生反应所需的基本装置。这些生长因子可能是由着床前的胚胎以自分泌方式而产生的，并调节其生长。编码细胞内信号分子的原癌基因在着床前胚胎中的表达，可能为着床时胚胎对子宫产生的生长因子发生反应而作准备。