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人免疫缺陷病毒1(HIV-1)膜蛋白基因片段在酵母中的克隆表达
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第1期第19卷 病毒学
作者：刘巍峰 高东 王祖农 滕智平 岑山 曾毅
单位：刘巍峰 高东（联系人）王祖农（250100 济南，山东大学微生物系微生物技术国 家重点实验室）；滕智平 岑山 曾毅（中国预防医学科学院病毒所）
关键词：人免疫缺陷病毒；基因；ENV；基因表达；癌基因蛋白质类；融合
【 摘要 】 目的 为获得足够量的膜糖蛋白，以便于对不同HIV分离株膜糖蛋白的结构与功能进行进一步的研究。方法 从人免疫缺陷病毒1(HIV-1)HXB2分离株原病毒基因组的重组质粒pHXB2中克隆了两段膜糖蛋白基因(ENV)片段。以酵母穿梭诱导表达质粒pYES2为载体，构建了两个相应的重组表达质粒pYENV1和pYENV2；进一步利用大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(β-lacZ)构建了HIV-1膜外糖蛋白DNA片段与β-lacZ基因的融合表达质粒。将此3种质粒分别转化单细胞真核生物酿酒酵母BJ1991，得到的转化子经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的SDS-PAGE分析。结果 克隆的基因片段在酿酒酵母中产生了分子质量为50×103的特异性诱导蛋白；对含此融合表达质粒的酵母转化子半乳糖诱导后表达产物的免疫检测表明，与对照菌株相比，融合表达产物具有和HIV-1阳性血清抗体反应的抗原性。结论 可通过β-半乳糖苷酶活性的测定直接指示抗原片段的表达；为表达的膜糖蛋白片段的进一步分离纯化打下了一定基础。
Cloning and expression of the envelope gene fragment from human immunodeficiency virus 1 in Saccharomyces cerevisiae LIU Weifeng, GAO Dong, WANG Zunong, et al. State Key Laboratory of Microbial Technology, College of Life Science, Shandong University, Ji'nan 250100
【 Abstract 】 Objective To acquire enough envelope glycoproteins so as to facilitate a further study of the structure and function of envelope glycoproteins from various kinds of virus isolates.Methods Two envelope glycoprotein gene fragments were cloned from the recombinant plasmid pHXB2 containing the human immunodeficiency virus 1(HIV-1) proviral genome of HXB2 isolate. Two corresponding expression plasmids pYENV1 and pYENV2 were constructed using a yeast shuttle inducible expression vector-pYES2. Furthermore plasmid pYENVG12 with the fused gene cassette between external envelope gene fragment and β-lacZ gene was constructed. These three plasmids were transformed into the unicellular eukaryotic S. cerevisiae BJ1991 and the galactose induced transformants were analyzed with the SDS-PAGE.Results The result showed that a 50kD specific protein induced from the transformant containing the fused plasmid was shown to have antigenic reactivity with HIV-1 antibodies positive sera by immunodetection.Conclusions Therefore not only could the expression of the antigenic fragment be directly indicated by the β-galactosidase activity, but also it laid some foundation for further purification of the fragment of the expressed envelope glycoproteins.
【 Subject words 】 HIV-1 Envelope glycoprotein gene Gene expression Fused gene inducible expression
人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)是引起获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的致病原，病毒粒子是具有双层脂膜的正二十面体结构。其分子质量为160×103的膜糖蛋白前体(gp160)在感染细胞内合成后被裂解成相对分子质量为120×103的膜外糖蛋白(gp120)和41×103的跨膜糖蛋白(gp41)〔1〕。gp120参予与靶细胞受体CD4的结合及合胞体的形成，gp41则介导病毒-宿主间的膜融合过程〔2〕。gp120是抗体中和与细胞免疫的主要靶位点〔3〕。因此在特异性诊断技术或在抗HIV疫苗设计中都是不容忽视的要素之一。酿酒酵母历来是化工与食品工业的重要生产菌株，也是一类适合真核外源基因表达的工程菌，对于某些大分子物质，其基因在酵母中的表达要远比原核生物优异。我们以酵母半乳糖可诱导的穿梭表达质粒pYES2为载体，研究了HIV-1膜蛋白基因的不同区域片段及gp120基因片段与大肠杆菌β-lacZ基因构成的融合基因在酿酒酵母中的表达。
材料与方法
1.菌株及质粒：大肠杆菌受体菌为JM109。酿酒酵母BJ1991(pep4-3,ura3,leu2,trp1,ga12,cir+)由北京微生物研究所蔡金科先生提供。质粒pHXB2与pBV221由中国预防医学科学院病毒所提供，其中pHXB2质粒含HIV-1 HXB2株原病毒全基因组。酵母穿梭表达载体pYES2由本所曲音波教授提供；表达β-半乳糖苷酶的质粒pYESGal系作者构建。
2.酶及其它试剂：限制性内切酶、连接酶、碱性磷酸酯酶及Southern杂交试剂盒分别为华美公司与Promega公司产品。
3.DNA操作技术：质粒制备、DNA片段分离回收、DNA连接、大肠杆菌转化、Southern印迹分析及原位杂交均按文献〔4〕方法进行。酵母完整细胞转化按Ito〔5〕方法进行。
4.酵母菌株的诱导及表达产物的SDS-PAGE：将酵母重组菌株接种于20ml SD-ura培养基，30℃振荡培养48小时，4000×g离心收集菌体，以生理盐水洗一次并把菌体全部转入20ml SG-ura培养基中，继续振荡培养12小时。取诱导后的培养物1.5ml,离心收集菌体，使之悬浮于250μl裂解缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0,2mmol/L EDTA,1mmol/L PMSF)中，以玻璃珠(0.45μm)涡旋振荡破碎，8000r/min离心去细胞碎片，上层破碎液加入等体积的2×上样缓冲液，煮沸5分钟，离心后备用。蛋白浓度以Folin-酚法进行测定。按常规方法制备垂直板电泳，分离胶浓度为12.5%，考马斯亮蓝染色，甲醇-冰乙酸脱色。
5.β-半乳糖苷酶活性的测定：按照Miller〔6〕的标准程序进行测定。酶活性单位按如下公式计算：
其中t、v分别为反应时间和反应样品的体积。
6.表达产物的免疫斑点：以HIV-1阳性血清为一抗，碱性磷酸酯酶偶联的兔抗人IgG抗体为二抗。上样、杂交及免疫显色均按常规方法进行〔7〕。
结 果
1.HIV-1膜糖蛋白基因(ENV)片段表达载体的构建：HIV-1 ENV基因以及所克隆基因片段的简单图示见图1。以HindⅢ酶切HIV-1 HXB2株原病毒基因组重组质粒pHXB2,产生的2.11kb DNA片段克隆到pGEM-3Zf(-)载体上得到pHH211-ENV。通过DNASIS软件对HXB2基因组全序列酶切位点分析已知2.11kb DNA片段包括了外膜糖蛋白(gp120)部分及跨膜糖蛋白(gp41)的部分序列。将pHH211-ENV质粒以KpnⅠ和HindⅢ双酶切，产生的1.8kb DNA片段克隆到带有起始密码子的原核表达载体pBV221上得到pBV18-ENV。将具备了ATG密码子的DNA片段以EcoRⅠ和SalⅠ(SalⅠ粘端以Klenow片段补平)切下，定向克隆到以EcoRⅠ和XbaⅠ(XbaⅠ粘端以Klenow片段补平)处理过的酵母穿梭表达载体pYES2上，得到pYENV1。Southern杂交证明克隆的1.8kb DNA片段确实来源于HIV-1基因组(图2，图3)。以EcoRⅠ酶解pBV18-ENV质粒，再以BglⅡ部分酶解，回收产生的1.3kb DNA片段先克隆入pBV211得到pBV13-ENV后再克隆到pYES2中，得到pYENV2(图4，图3)。
图1 HIV-1 ENV基因及所克隆基因片段的简单图示
Fig 1. The simplified diagram of HIV-1 ENV gene and cloned gene fragment
图2 重组质粒pYENV1的限制性酶切电泳及Southern杂交分析
Fig 2. Restriction and Southern blot analysis of the recombinant plasmid pYENV1
A a.pHXB2/HindⅢ，B b.λDNA/HindⅢ,C c.pHH211-ENV/HindⅢ,D d.pBV18-ENV/EcoRⅠ+PstⅠ,E e.pYENV1/HindⅢ,F f.pYENV1/NcoⅠ,G g.pYES2/HindⅢ
图3 构建的重组表达质粒pYENV1,pYENV2及pYENVG12
Fig 3. The constructed recombinant expression plasmid pYENV1,pYENV2 and pYENVG12
图4 重组质粒pYENV2的酶切分析
Fig 4. Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pYENV2
1.pBV13-ENV/EcoRⅠ+PstⅠ,2.λDNA/HindⅢ,3.pYENV2/EcoRⅠ+XbaⅠ,4.pYENV2/BglⅡ,5.pYES2/NcoⅠ,6.pYENV2/NcoⅠ,7.pYENV1/NcoⅠ
2.HIV-1外膜糖蛋白(gp120)DNA片段与β-lacZ基因融合表达质粒的构建：HIV-1 gp120片段3'末端及β-lacZ基因5'末端的序列已知，为了使两者编码框架的融合，先以KpnⅠ酶切pYESGal,补平产生的粘端，再以XbaⅠ完全酶切，回收3.4kb的β-lacZ基因片段；以SalⅠ和EcoRⅠ同样处理回收pBV13-ENV中的1.3kb ENV片段，两片段同时克隆到EcoRⅠ和XbaⅠ酶切的载体pYES2中，得到了ENV(gp120)-lacZ融合表达质粒pYENVG12(图5，图3)。
图5 融合表达质粒pYENVG12的酶切电泳
Fig 5. Restriction enzyme analysis of fused expression plasmid pYENVG12
1.λDNA/HindⅢ,2.pYENVG12/EcoRⅠ,3.pYENVG12/HindⅢ+XbaⅠ,4.pYENVG12/HindⅢ,5.pYES2/HindⅢ,6.λDNA/HindⅢ
3.HIV-1膜糖蛋白片段在酿酒酵母中的表达：将上述构建的3种质粒分别转化进酿酒酵母。半乳糖诱导培养后，对含pYENV1和pYENV2的重组酵母菌株进行SDS-PAGE分析发现，pYENV2在酵母中诱导表达了相对分子质量为51×103的蛋白分子，与预定的计算分子量一致(图6)；pYENV1转化重组菌株虽然在理论分子质量(约68×103)位置的蛋白量极少，但也在51×103位置出现了诱导蛋白带。我们认为是pYENV1中克隆的ENV片段产物包含了前体蛋白的裂解位点而造成诱导表达产物在细胞内的裂解所致。不同浓度半乳糖下测得的pYENVG12转化重组菌株中β-半乳糖酶活性见图7。诱导表达产物的免疫斑点杂交结果(图8)表明，与对照菌株相比，pYENVG12重组菌株诱导产物中含有和HIV-1阳性血清抗体反应的抗原物质。如果按照每毫克纯β-半乳糖苷酶的酶活性单位为30万，则由所测得的胞内β-半乳糖苷酶活性可计算出产生的融合蛋白约占细胞总蛋白含量的1.4%。
图6 重组酵母(pYENV1及pYENV2)半乳糖诱导表达的SDS-PAGE
Fig 6.The SDS-PAGE analysis of galactose induced products from the recombinant yeasts (pYENV1 and pYENV2)
1.Low molecular protein marker,2-6.YT9(pYENV2),7-9.YT9(pYENV1),10.YT9
图7 不同浓度半乳糖对ENV(gp120)-lacZ融合蛋白的诱导表达
Fig 7. The induced expresion of ENV(gp120)-lacZ fusion protein under different concentrations of galactose
图8 诱导表达产物的免疫斑点杂交分析
Fig 8. Dot immunoblot detection of expression products
A.YT9(pYENVG12),B.YT9(pYESGal)
讨 论
到目前为止已在大肠杆菌〔8〕、重组杆状病毒〔9〕、腺病毒〔10〕及中国仓鼠卵巢细胞〔11〕中表达了HIV-1 gp160片段，但存在表达水平低以及免疫活性方面等问题。Barr等〔12〕曾报道过在酵母中表达HIV-1包膜蛋白基因片段，其结果显示，产生的非糖基化重组gp120蛋白虽然能诱导产生中和抗体，但诱导产生的抗体具有株特异性，因此有必要研究ENV不同区域及来源不同毒株ENV片段诱导产生有效于各种HIV分离株的中和抗体的能力。研究已发现HIV-1膜糖蛋白对细胞具有直接的毒害乃至致死作用〔13〕。因此我们选择了酵母半乳糖可诱导表达系统。实验结果表明，HIV-1膜蛋白基因片段在酵母中表达，表达的蛋白产物诱导产生中和抗体及保护性免疫的能力有待进一步的研究。
研究发现含有病毒蛋白抗原表位区域的β-半乳糖苷酶融合分子可以诱导产生针对该蛋白抗原的特异性抗体，由于β-半乳糖苷酶能形成具有酶活性构象的四体复合物，这样表达产生的融合蛋白中抗原表位区域的拷贝数也可能随之增加。表达的融合蛋白因为含有活性β-半乳糖苷酶部分，因此可以大大简化纯化的程序〔14〕。
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(收稿：1997-06-02 修回：1998-05-11)