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比较两种检测麻风菌鼻携带的方法
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第1期第19卷 免疫检测
作者：翁小满 钱立石 朱伉 李桓英 J.T. Douglas
单位：翁小满 李恒英（100050 北京热带医学研究所）；钱立石 J.T Douglas（美国夏威夷大学微生物系）；朱伉（云南省皮肤病和性病防治研究所）
关键词：麻风；免疫印迹；酶联免疫吸附测定；聚合酶链反应；化学发光
【 摘要 】 目的 选用简便、快速、经济的麻风菌鼻携带检测法，评价麻风病传播及防治效果。方法 采用PCR和Dot-ELISA/ECL平行检测鼻分泌物中麻风菌及其酚糖脂(PGL-1)抗原。以5种分枝杆菌为对照，评价两试验的特异性；以45例不同治疗状态的麻风患者和143名接触者的检测，比较两试验的敏感性。结果 PCR的阳性检出率略高于Dot-ELISA/ECL，经配对χ2检验，差异没有显著性。结论 Dot-ELISA/ECL较PCR简便、快速、经济，是一项适用于现场研究的麻风流行病学工具。此外，属聚氟乙烯类的GVHP膜是适合于检测粘膜分泌物抗原的载体。
Comparison of two methods for detection of M.leprae nasal carriage WENG Xiaoman*, QIAN Lishi, ZHU Kang, et al. *Beijing Tropical Medicine Research Institute, Beijing 100050
【 Abstract 】 Objective To select a more simple, rapid and cost-effective laboratory method for detecting M.leprae nasal carriage in order to evaluate transmission of leprosy and efficiency of leprosy control.Methods PCR and Dot-ELISA/ECL were applied to detect parallel M.leprae and PGL-1 antigen. Five Mycobacteria were used as control to evaluate the specificity of the two tests. Forty five leprosy patients with different status of treatment and 143 leprosy contacts were used to compare the sensitivity of the two tests.Results The two tests were of ideal specificity and no significant statistic difference was found although the positivity of PCR was higher than Dot-ELISA/ECL.Conclusion Dot-ELISA/ECL is a more simple, rapid and cost-effective tool for epidemiological study of leprosy. In addition, GVHP membrane is a suitable supporter to detect mucosa secretive antigens.
【 Subject words 】 Leprosy M.leprae nasal carriage Dot-ELISA/ECL Polymerase chain reaction
鼻腔是麻风菌进入人体的门户，也是排出的通道，因而是麻风病传播的主要途径。既往的鼻腔切割查菌，不仅敏感性低，而且具有损伤性。PCR检测已证实麻风流行区人群的麻风菌鼻携带的存在〔1，2〕。然而在发展中国家，PCR仍难以作为流行病学的研究工具。为了更好了解鼻携带在麻风病传播、持续中的作用, 有必要建立更简便、快速、经济的方法。本文运用PCR和斑点-ELISA/增强化学发光（Dot-ELISA/ ECL, Enhanced chemoluminescent）平行检测鼻分泌物中的麻风菌及其酚糖脂 (PGL-1) 抗原，评价Dot-ELISA/ ECL的特异性、敏感性及在麻风防治中的实用性和可行性。
材料与方法
病例标本：32份鼻拭子，鼻分泌物涂膜，取自中国云南文山州麻风患者〔新病人8例，联合化疗(MDT)少于6个月19例；MDT后5例〕；143份麻风病接触者的鼻拭子及鼻分泌物涂膜标本,取自菲律宾Culion岛上的麻风村，用作平行检测鼻腔分泌物中麻风菌及PGL-1抗原。13份鼻拭子，鼻分泌物涂膜取自河北省皮肤病防治院麻风治愈者，用作对照。
标本收集及处理：使用鼻拭子（美国Mardwood制品公司生产）将鼻分泌物涂在GVHP膜（美国Millipore公司)。涂前将GVHP浸泡于PBS中，10分钟后取出，自然干燥后使用。用涂膜检测PGL-1抗原，用鼻拭子再取分泌物，检测其中的麻风菌DNA。
鼻拭子麻风菌DNA的分离与提取： 将鼻拭子头剪下，浸泡于300μl裂解液（0.1mol/L Tris-HCl pH 8.5，0.05% Tween20，蛋白酶K 1mg/ml），60℃温育，过夜，次日97℃，10分钟，灭活蛋白酶活性，取20μl作PCR模板用。如果标本在2％琼脂糖凝胶电泳上显示有较高的非特异性反应背景，则减少模板量或用硅藻土（diatom）与L6缓冲液（120g guanidinium thiocyanate, 22ml 0.2mol/L EDTA, 2.6g Triton X-100, 100ml 0.1mol/L tris-HCl, pH 6.4) 纯化蛋白酶K处理后的标本，再行PCR。
Dot-ELISA/ECL:抗原抗体反应同Dot-ELISA，抗麻风菌PGL-1分泌性抗原的单克隆抗体DZ-1（美国夏威夷大学微生物系Dr. Douglas实验室研制）1∶1000，HRP-IgG 1∶6000。反应后，使用ECL for Western blotting试剂盒（美国Amersham 生命科学公司），经化学发光自显影技术，将反应结果显示在X光胶片上。
PCR：引物S-13，S-62扩增531bp片段〔1〕。反应总体积50μl，模板20μl，反应物含5μl 10×PCR缓冲液，引物各10 pmol/L，dATP、dGTP、dCTP，dUTP各200μmol/L，0.5U uNG(尿嘧啶-N-糖基化酶)和0.5U Taq酶，共行35个循环。
对照:1∶10系列稀释109/ml麻风菌（WHO提供）后，用Petroff板，在相差显微镜下，核实其计数是否为108，107，……103条菌/ml。从上述不同浓度菌液中，分别取10μl，即含106，105，……101条菌，各滴加到无菌鼻拭子头上，自然干燥，用作PCR阳性对照，用三蒸水作阴性对照。另取10μl 104 /ml麻风菌和10μl水滴加到GVHP膜上，用作Dot-ELISA/ ECL 阳性和阴性对照。
结果判断: 2％琼脂糖凝胶电泳后分析，Southern转印， PCR产物标记探针，杂交后，ECL-自显影检测。以杂交后结果判断。
结 果
PCR与Dot-ELISA/ ECL的特异性： 以5种常用分枝杆菌为对照，评价Dot-ELISA/ ECL特异性。图1显示：当菌量＞1011/ml，除耻垢分枝杆菌与麻风菌有交叉反应（＜1011/ml无交叉），其它分枝杆菌未见有交叉反应。该试验可检测103～104 麻风菌分泌的抗原。
图1 抗麻风菌PGL抗原单抗检测分枝杆菌的Dot-ELISA/ECL的特异性
Fig 1. The specificity of Dot-ELISA/ECL with DZ-1 monoclonal antibody against PGL of M.leprae to detect mycobacteria
PCR与Dot-ELISA/ ECL敏感性的比较： 图2显示，PCR可检测麻风菌的水平为103～102/ml，因仅取10μl的lysate作PCR模板，实际可检测水平即为3～30条菌, 与图1相同。Dot-ELISA/ ECL可检测103～104/ml麻风菌分泌的抗原。
图2 检测麻风菌的PCR和Dot-ELISA/ECL方法的敏感性与特异性比较
Fig 2. Comparison of sensitivity and specificity of PCR and Dot-ELISA/ECL for detection of M.leprae
PCR、Dot-ELISA/ ECL平行检测143例麻风接触者鼻分泌物：表1显示，PCR、Dot-ELISA/ ECL阳性率分别是44％和37％, 经配对资料的卡方检验，差异无显著性（χ2 = 2, P＞0.05），两法一致率为65％。
表1 用以检测麻风接触者鼻分泌物的PCR和Dot-ELISA/ECL的相关性
Table 1. Correlation between PCR and Dot-ELISA/ ECL for detection of M.Leprae in nasal secretion from leprosy contacts
| Dot-ELISA/ECL | PCR | ||
| Positive | Negative | Total | |
| Positive | 33(a) | 20(b) | 53 |
| Negative | 30(c) | 60(d) | 90 |
| Total | 63 | 80 | 143 |
分泌物中的PGL-1抗原： 表2显示, Dot-ELISA/ECL与PCR的敏感性，差异均无显著性。比较各组检出率，新病人的阳性率均高于治疗中的病人(Dot-ELISA/ECL P＜0.01; PCR P＜0.05)。
表2 用PCR和Dot-ELISA/ECL检测麻风菌及其PGL-1抗原
Table 2. Detection of M.leprae and PGL-1 antigen with PCR and Dot-ELISA/ECL
| No.sample | Dot-ELISA/ECL | PCR | ||||
| Total | Positive | % | Total | Positive | % | |
| Untreated | 8 | 7 | 89.5 | 8 | 6 | 75.0 |
| Under MDT
(＜6月) |
19 | 5 | 26.3 | 19 | 4 | 21.1 |
| Treated
(after MDT) |
5 | 0 | 0 | 5 | 2 | 40.0 |
| Cured | 13 | 0 | 0 | 13 | 0 | 0 |
| Total | 45 | 12 | 26.7 | 45 | 12 | 26.7 |
讨 论
迄今，麻风菌的体外培养仍未成功，因而建立检测病原菌的方法尤为重要。已有研究证实了麻风菌鼻携带的存在，并认为麻风流行区鼻携带可以反映麻风病传播及持续与否〔3,4〕。尽管一般人群的阳性鼻携带并不都意味着感染或麻风菌的排出。但是，探讨应用麻风菌鼻携带的检测，评价麻风病防治效果及预测流行趋势的实用性，却十分必要。
80年代后，麻风菌特异性PGL-1抗原的发现，促进了麻风血清学的发展。虽然已意识到检测血清及其它体液中的PGL-1抗原更具有早期诊断和疗效考核的价值，但因PGL-1是一种脂质类抗原，检测前均需对标本进行脂质抽提〔5,6〕。GVHP是一种疏水性膜，对分泌性PGL-1抗原吸附性好。与检测血清、尿等体液中麻风菌PGL抗原方法相比，不需对标本进行脂质抽提，直接将分泌物涂在膜上，即可检出。此法同样可检测皮肤组织液中的PGL-1抗原，因此此法更简便、快速、经济，适合我国现场应用。
Dot-ELISA/ECL是一种非放射性的化学发光免疫检测特异性抗原的方法，敏感性高于Dot-ELISA。在化学发光增强剂酚存在的作用下，辣根过氧化物酶激发鲁米诺发光，通过自显影技术，将免疫反应结果永久保留在X光片上。Douglas等将此法用于前瞻性的流行病学监测，以此评价联合化疗(MDT)后麻风病的传播是否在高流行区得到控制〔7〕，DZ-1单抗与5种分枝杆菌均不产生交叉反应，尽管对高浓度的耻垢杆菌有交叉，但此菌是在人体生长具有部位限制性的非致病菌。
虽然，就检测麻风菌菌量而言，PCR的检测水平明显高于Dot-ELISA/ECL，但两法检测同批患者的鼻分泌物，阳性率却无差异，检测接触者也无明显差异，PCR并未显示明显的优势。估计原因有：①由于两法检测麻风菌不同的组份，难以比较相关性。Dot-ELISA/ECL检测分泌性PGL-1抗原，但是否仅分泌的抗原与活菌有关〔8〕，目前尚不清楚。而PCR却能检测死、活菌；②用拭子取鼻分泌物，菌量较少，如再用酚、氯仿提取后，DNA含量相应较少。因此本文采用粗提法，简便快速，适合大样本的检测。但是，粗提法不能去除分泌物中的抑制物。而抑制物可能致使PCR的假阴性产生，从而降低了它的敏感性；③在Dot-ELISA/ECL检测中，有时出现较高的非特异性背景，难以区分少数标本的真、假阳性，这种背景的产生估计与GVHP膜的机械性损伤，如摩擦、涂力过大有关。我们的结果显示，MDT治疗少于6个月患者，无论是麻风菌或PGL抗原，鼻携带率较未用MDT明显下降；治愈者也无麻风菌的携带和排除。这进一步证明了MDT能迅速清除麻风菌。但是，对临床上难以鉴别复发与反应的5例MDT后患者，虽仅2例鼻分泌物PCR阳性，Dot-ELISA/ECL均为阴性。因此，为了提高诊断和监测复发的水平，应用检测麻风菌活性的分子生物学试验，如3SR（self-sustaining sequence replication）或NASBA〔9〕鉴别死菌与活菌。
1993年De wit等人对印度尼西亚麻风流行区人群进行麻风菌鼻携带检测〔4〕，两年后随访研究显示，虽然人群鼻携带阳性率没变化，但原阳性携带者均阴转〔9〕。本研究检测的麻风病接触者，除鼻携带率高于上述报道外，少数阳性者持续鼻携带达3～4年（另报道）。这除了与环境中麻风菌暴露强度相关外，尚需进一步追踪，探讨鼻携带持续的原因。无疑，进一步应用Dot-ELISA/ECL评价流行区麻风防治效果，具有推广前景。
志谢：感谢云南省皮肤病防治研究所、云南省文山州皮肤病防治研究所予以现场工作的支持。
本研究受菲律宾Culion基金会资助
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(收稿：1997-11-11 修回：1998-03-30)