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猪卵透明带-3α基因在大肠杆菌中的融合表达和鉴定
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第2期第19卷 基础免疫学
作者：徐万祥 谢毅 王健 邱德义 刘建平 李昌本 赵寿元 Don Powell Roy Jones
单位：徐万祥 王健 邱德义（200032 上海市计划生育科学研究所）；谢毅 刘建平 李昌本 赵寿元（复旦大学）；Don Powell, Roy Jones（Cambridge CB2 4AT, U.K., The Babraham Institute ）
关键词：猪ZP3α；cDNA；大肠杆菌；基因表达
【 摘要 】 目的 通过遗传工程获得ZP3α融合蛋白,以便用表达产物制备ZP3α单克隆抗体。方法 根据重新测序的猪ZP3α cDNA 5'端非编码碱基数, pWR450表达质粒家族的pWR450-2被选用来表达β-半乳糖苷酶(LacZ)/ZP3α融合蛋白。带5'端非编码区和信号顺序的全长ZP3α cDNA片段, 用EcoRⅠ酶切自pZ58质粒, 然后被重组插入pWR450-2质粒中被截短LacZ'基因的3'端多克隆区。此重组质粒转化大肠杆菌TG1后, ZP3α融合蛋白的表达通过IPTG诱导。结果 在1mmol/L IPTG存在下可观察到LacZ/ZP3α融合蛋白在大肠杆菌中的表达, 表达量约占总细菌蛋白的5%。在SDS-PAGE上, 融合蛋白显示相对分子质量为10.2×104。在蛋白印迹实验中, 融合蛋白显示了与兔抗猪ZP IgG的特异免疫学反应。结论 猪ZP3α融合蛋白的可获得性将有助于今后开展制备抗ZP3α单抗和评价它的抗生育功效等研究。
Expression and identification of recombinant pig ZP3α cDNA in E.coli XU Wanxiang*, XIE Yi, WANG Jian, et al. *Shanghai Institute of Planned Parenthood Research, Shanghai 200032
【 Abstract 】 Objective The zona pellucida (ZP) surrounding pig oocytes is the unique extracellular matrix composed of three sulfated glycoproteins (ZP1, ZP3α and ZP3β). It has been demonstrated that the ZP3α possesses sperm-binding activity and cross-reactive antigenicity with human ZP in vitro. Therefore, the ZP3α has been thought to be a potential immunogen for developing human contraceptive vaccine. Because it is very difficulty to isolate natural ZP3α, the main objective of the present study is to obtain ZP3α fusion protein by genetic engineering in order to make monoclonal antibodies against ZP3α by using the expression protein.Methods According to the 5' end noncoding base pair number of pig ZP3α cDNA which was re-sequenced, the pWR450-2 vector of pWR450 expression plasmid family was chosen to express β-galactosidase (LacZ)/ZP3α fusion protein. The 1 700bp fragment of ZP3α cDNA with 5' end noncoding region and signal sequence was excised from plasmid pZ58 by EcoRI digestion and inserted into the 3' end polyclonging region of the truncated Lac Z' gene (1 395bps) in pWR450-2 plasmid. Then, the recombinant plasmid was transformed into E.coli TG1 and the expression of the fusion protein was induced by IPTG.Results The re-sequenced data showed that there was a base T missing between position -20 and -19 in the published 5' end noncoding region of ZP3α cDNA. The expression of LacZ’/ZP3α fusion protein in E.coli TG1 was observed at 1mmol/L IPTG, which the expressed product amount was about 5% of the total bacterial protein. On the SDS-PAGE gel, the fusion protein display ecular weight of about 102kD matching with its deduced molecular mass. In addition, the fusion protein showed specific immunological reaction with anti-pig ZP IgGs of rabbit in Western blotting test. This indicated that the expressed product was fusion protein with antigenic activity of pig ZP3α protein. Conclusion Collectively, the availability of pig ZP3α fusion protein will further help in making monoclonal antibody against ZP3α and evaluating its efficacy for fertility regulation.
【 Subject words 】 Pig ZP3α cDNA Escherichia coli Gene expression
ZP是脊椎动物卵母细胞外的一层丝状体酸性糖蛋白, 现已从基因水平证实它由定名为ZP1、ZP2和ZP3(或ZPA、ZPB和ZPC)的3种糖蛋白组成〔1〕。由于ZP是卵巢独有的, 在卵泡发育和精卵受精过程中起着十分重要的作用〔2〕, 所以长期以来ZP, 特别是猪ZP (pZP)一直是哺乳动物受精生物学中的重要研究对象, 并被认为是可通过免疫干扰精卵结合而达到抗生育效果的潜在靶抗原〔3〕。
pZP对异种动物具有很强的免疫原性, 并已证实pZP3抗体与人ZP有交叉反应, 并阻断人精卵细胞相互作用〔4，5〕, 从而成为研制人类免疫避孕疫苗的热门抗原之一。现已清楚pZP3蛋白由pZP3α和pZP3β两个组份构成〔1，5〕, 其中的pZP3α为猪精子受体〔6〕。根据最近克隆的 pZP3α cDNA全序列, 蛋白电泳推断相对分子质量为55×103(去糖基化后为37×103)的pZP3α 由536个氨基酸组成, 包括21个残基的信号肽顺序〔7〕。
由于从猪卵巢中分离纯净的pZP3α蛋白十分困难, 因此为了制备pZP3α单抗和评价pZP3α的抗生育效果和安全性, 我们试图通过基因工程获得这一目的蛋白。本文首次报道了pZP3α cDNA在大肠杆菌中以融合蛋白形式的表达。
材料与方法
1. 菌株与质粒:大肠杆菌TG1为转化受体菌, pZ58(pBS/pZP3α)由美国Zonagen Inc. Harris博士馈赠, 细菌表达质粒由上海细胞生物学研究所郭礼和研究员构建〔8〕。
2.试剂与酶:限制性内切酶及其它工具酶购自Boehringer Mannheim公司, 牛小肠碱性磷酸酶(CIP)购自Biolabs公司, DNA纯化试剂盒为Promega公司产品, DNA序列分析试剂盒购自 Applied Biosystems公司, 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、小牛血清白蛋白(BSA)、羊抗兔IgG/辣根过氧化物酶、联苯二胺(DAB)、DNA和蛋白质相对分子质量标准均购自华美生物工程公司。
3. 猪ZP和兔抗猪ZP IgG材料:猪ZP的分离按文献〔9〕方法进行。兔抗猪ZP抗血清过蛋白A层析柱, 用0.1mol/L甘氨酸缓冲液(pH3.0)冲洗的IgG收集液在对水透析后冷冻干燥保存。
4.目的基因和表达载体的制备及pWR450-2/pZP3α重组质粒的构建:按《分子克隆》实验手册的方法进行〔10〕。
5. 目的基因5'端的DNA序列分析:用pZ58双链质粒DNA直接测序。经DNA纯化试剂盒提取的pZ58 DNA在ABI373A型DNA测序仪上进行生物素荧光标记DNA序列自动分析。
6.表达产物的分析鉴定:重组质粒转化感受态大肠杆菌TG1后,在加氨苄青霉素的LB固体培养平板上, 挑取一转化菌落于LB培养液中培养过夜。第二天在转接培养的新鲜LB液(吸光度A600值约为0.5)中, 加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导培养4小时。收集的1ml菌体沉淀用2×上样缓冲液溶解, 煮沸离心后取15μl上清作SDS-PAGE分析。Western blotting试验中兔抗猪ZP IgG为第一抗体, 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为第二抗体, 显色剂用DAB, 操作按厂家说明书进行。
结 果
1.pZP3α cDNA 5'端非编码区的DNA序列分析:按已发表的pZP3α基因5'端非编码区碱基数目〔7〕, 我们选择了pWR450系列中符合pZP3α基因阅读框要求的pWR450质粒, 然而构建的pWR450/pZP3α重组质粒经IPTG诱导后, 在SDS-PAGE时未见到特异的蛋白表达条带。为此, 作为可能的原因之一, 我们重新测定了pZ58质粒中pZP3α基因5'端的DNA序列(测序图未列出)。
从测序后阅读的pZP3α cDNA 5'端301个碱基序列中, 发现在原报道的阅读框之前非编码区-20和-19之间缺失1个碱基T, 这与我们先前估计非编码区碱基数可能有误而造成重组融合基因转译提前终止的判断一致。该克隆基因5'端非编码区的实际序列应是:
-21-20-19
5'-GAATTCCGGGTGGAAGTATCCTGTTCTCCGCAGG
EcoRI克隆位点 *
+1
CGCTATG - 3'
起始密码子
2.重组质粒pWR450-2/pZP3α的构建:按上述DNA测序结果, 重新选择了真正适合pZP3α基因阅读框的pWR450-2表达质粒。pWR450/pZP3α重组质粒的构建按图1程序进行。
图1 重组质粒pWR450-2/pZP3α的构建
Fig 1.Construction of recombinant plasmid pWR450-2/pZP3α
E. EcoR Ⅰ；B. BamH Ⅰ；H . Hind Ⅲ；CIP . calf intestinal alkaline phosphatase
全长1700bp的pZP3α cDNA片段,在T4 DNA连接酶作用下被重组插入pWR450-2中LacZ'截短基因3'端多克隆区的EcoRⅠ酶切位点。连接反应液转化大肠杆菌TG1后, 选择Apr转化菌扩增培养后进行碱裂解法快速抽提。通过EcoRⅠ酶切鉴定有无pZP3α基因片段插入(图2), 获得的pWR450-2/pZP3α重组质粒因是单酶切插入, 所以还需要用HindⅢ酶切鉴定目的基因的插入方向, 正向插入的重组质粒应在5%聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示153bp的片段条带(图3)。
图2 重组质粒pWR450-2/pZP3α的酶切鉴定
Fig 2. 1% agarose gel analysis of pWR450-2/pZP3α recombinant DNA after digestion by EcoR Ⅰ
M.λDNA/HindⅢ maker； a.EcoRⅠ digestion of pZ58； b.EcoRⅠ digestion of pWR450-2； c.EcoRⅠ digestion of pWR450-2/pZP3α；d.BamHⅠ digestion of pWR450-2/pZP3α
图3 重组质粒pWR450-2/pZP3α的插入方向酶切鉴定
Fig 3. 5% PAGE analysis of pWR450-2/pZP3α recombinant DNA after digestion by Hind Ⅲ
M. pGEM-7zf(+)/Hae Ⅲ maker
s. Hind Ⅲ digestion of pWR450-2/pZP3α
3. LacZ'/pZP3α融合基因在大肠杆菌中的表达: 重组质粒pWR450-2/pZP3α转化大肠杆菌TG1, 经IPTG诱导后取15μl菌体裂解液作10% SDS-PAGE分析, 结果在相对分子质量10.2×104处存在预期的β-半乳糖苷酶-pZP3α融合蛋白表达条带, 其电泳相对分子质量与理论推算值基本吻合(图4)。薄层凝胶吸光度扫描显示此表达蛋白占菌体总蛋白的5%左右。在图4中还能见到与10.2×104处条带表达量相当但相对分子质量明显小很多的另一78×103融合蛋白次带。
图4 表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
Fig 4. SDS-PAGE of expressed proteins
M. Standard protein maker；a. E.coli TG1 control；b.pWR450-2/TG1 control (IPTG induced)；c,d.pWR450-2/pZP3α/TG1 control (IPTG induced)
4. 表达LacZ'/pZP3α融合蛋白的特异性鉴定:用SDS-PAGE分析中重复顺序上样的另一半凝胶进行融合蛋白表达产物的Western blotting试验, 结果10.2×104处的LacZ'/pZP3α融合蛋白条带可被兔抗猪ZP IgG(含多克隆兔抗猪ZP3α IgG)识别(图5), 而正常兔血清IgG与表达的融合蛋白呈阴性反应, 证明本实验表达的融合蛋白具有抗原特异性。此外, 图4中另一特异的78×103表达条带也与兔抗猪ZP IgG呈阳性反应。
图5 表达产物的Western blotting鉴定
Fig 5. The result of Western blotting
a. E.coli TG1 control
b.pWR450-2/TG1 control (IPTG induced)
c,d.pWR450-2/pZP3α/TG1 control (IPTG induced)
讨 论
质粒pWR450-2利用了LacZ基因的启动区、SD自然序列和截短的LacZ'基因(编码N端461个氨基酸), 并在其3'端接有供插入外源基因的多克隆部位, 因而它是一个较为理想且应用方便的融合蛋白表达载体〔8〕。
本研究中LacZ'/pZP3α融合蛋白表达量仅占总细菌蛋白的5%(一般大分子融合蛋白表达量可达到10%左右), 这可能是由于融合的外源基因蛋白产物对细菌有毒性, 而被细菌应激产生的蛋白酶部分降解的缘故。与图4中对照菌蛋白条带相比, 除可被特异抗体识别的78×103降解条带外, 还存在几条相对分子质量更小的可辨降解蛋白条带。因此, 为了提高目的蛋白表达量, 下一步将摸索最佳诱导表达条件, 包括选用不同的蛋白酶缺失宿主菌。
质粒pWR450-2表达的截短β-半乳糖苷酶的理论相对分子质量是53×103, 成熟pZP3α去糖基化后的电泳相对分子质量是37×103〔6〕, 而我们在SDS-PAGE上观察到的未降解LacZ'/pZP3α融合蛋白条带的相对分子质量则为10.2×104, 但算上pZP3α蛋白的21个残基信号肽以及ZP3α基因5'端非编码区碱基和pWR450-2多克隆区部分碱基所编码16个残基的相对分子质量, 那么该完整融合蛋白的相对分子质量与理论相对分子质量还是比较接近的。在本研究中目的融合蛋白的相对分子质量略大于理论相对分子质量的原因尚不清楚, 但类似现象在其它融合蛋白表达研究中也时有发生〔11〕。
此外, 在SDS-PAGE中还能见到另一可被兔抗猪ZP IgG识别的78×103表达条带, 这可能是10.2×104融合蛋白的降解产物。这一现象在同样以pWR450-2为表达载体的pZP3α融合蛋白表达研究中也存在(另文发表), 根据它们的各自两条融合蛋白条带(可被特异抗体识别)间距不同的电泳图谱, 可推断LacZ'/pZP3α融合蛋白的主要降解位点应该在pZP3α蛋白内。
猪ZP各组分蛋白的分离十分困难, 且难保证它们的纯度。例如, 用从猪ZP3蛋白拆分出的pZP3α和pZP3β蛋白制备单抗, 两者同非对应抗原就有交叉反应〔12〕。因此, 用遗传工程方法制备ZP中目的抗原(或融合蛋白)已形成当前ZP研究的热点。但国外已报道的1例兔55×103 ZP(pZP3α同源物)融合基因在大肠杆菌中的表达, 未能出示清晰的电泳图照〔13〕。我们应用DNA重组技术, 首次成功地在原核生物中表达了pZP3α融合蛋白, 并达到一定的表达量。这一研究结果将为以后制备特异的抗pZP3α单抗, 以及用此表达产物开展pZP3α抗生育功效和安全性等研究奠定基础。
志谢：美国得克萨斯州Zonagen公司的Jeffrey D. Harris博士提供了pZ58质粒, 复旦大学生化系黄伟达博士帮助做了目的融合蛋白表达量的凝胶薄层密度扫描, 在此一并感谢。
本课题受世界卫生组织人类生殖研究、发展和培训特别规划署(WHO-HRP)及国家教育委员会留学回国人员科研费资助
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(收稿：1997-10-13 修回：1998-02-20)