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中国钩端螺旋体强毒株017膜蛋白基因的质粒载体构建及表达
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第2期第19卷 钩端螺旋体
作者：晏菊芳 鲍朗 伍卫华 万波 李胜富
单位：610041 成都，华西医科大学钩端螺旋体病研究室
关键词：钩端螺旋体属；细菌外膜蛋白质类；重组质粒；基因表达
【 摘要 】 目的 构建表达我国钩体强毒赖型017株外膜蛋白的重组质粒。方法 用PCR方法扩增并回收017株钩体外膜蛋白基因片段OmpL1，将其与质粒pBK-CMV重组，通过菌落颜色和酶谱分析筛选出重组质粒。然后从该重组质粒切下OmpL1基因片段，重新克隆至质粒pBV220中，酶谱分析和DNA杂交鉴定出正向重组质粒。将含有正向重组质粒的宿主菌诱导表达生长后，提取全菌总蛋白进行SDS-PAGE分析。结果 筛选出4个与pBV220正向重组的质粒，其中一株带重组质粒pBLM1的菌株表达了一相对分子质量为33.5×103的新蛋白。结论 重组质粒pBLM1的构建和表达成功说明扩增得的OmpL1基因具有完整的阅读框架，并使简便获得大量天然的017株钩体OmpL1蛋白成为可能，为新型钩体疫苗的研究奠定了基础。
Construction and expression of the plasmid vector of an outer envelope protein gene from the strong virulent Leptospira，strain 017 in China YAN Jufang， BAO Lang， WAN Bo， et al. Research Centre of Leptospirosis, West China University of Medical Science, Chengdu 610041
【 Abstract 】 Objective Constuction of a recombinant plasmid expressing an outer envelope protein from the strong virulent Leptospira, serovar Lai strain 017.Methods The OmpL1 outer envelope protein gene was amplified from the genome of the Leptospira, strain 017. The removed OmpL1 gene was recombined with plasmid pBK-CMV and the recombinant plasmid was selected according to the colour of bacterial colony and analysis of restriction enzymes. Then the OmpL1 gene was cut out from the recombinant plasmid and was cloned to plasmid pBV220 again. The recombinant plasmids with proper orientation was identified with analysis of restriction enzymes and DNA hybridization and selected . The host bacteria containing recombinant plasmids with proper orientation grew with heat induction , and the complete protein of the bacteria was extracted for SDS-PAGE.Results Four recombinant plasmids with proper orientation, which ligated with pBV220, were obtained. One of the four recombinant plasmids, pBLM1, expressed a new protein with a weight of 33.5kD.Conclusions The success of construction and expression of recombinant plasmid pBLM1 has indicated that the OmpL1 gene obtained by PCR has a complete reading frame. And it supposes to be possible to use strain 017 for getting natural OmpL1 protein of Leptospira in quantity. The above work has laid a necessary foundation for future research on a new vaccine of Leptospira.
【 Subject words 】 Leptospira Outer envelope protein Recombinant plasmid Gene expression
钩端螺旋体（简称钩体）病是一种世界流行的人兽共患疾病，对人类健康和畜牧业造成严重危害和影响。目前国内外所用的钩体疫苗免疫保护作用有限，因此，发展新型钩体疫苗势在必行。无论是基因工程蛋白疫苗还是最新出现的核酸疫苗都必须有一个良好的保护性抗原。钩体外膜蛋白一直被认为具有良好的抗原性，我国的强毒017株尤其如此〔1〕。OmpL1外膜蛋白是Haake〔2〕等1993年从钩体L.kirschneri株上克隆并测序出的第一个完整的钩体外膜蛋白。研究证实，该蛋白基因以单拷贝形式存在于所有致病钩体的基因组中，有暴露于细胞表面的抗原表位，由此推测OmpL1蛋白可能是钩体疫苗抗原的较好选择。鉴于此，我们采用PCR法从017株钩体基因组中扩增出OmpL1蛋白基因，将其重组入质粒，以期迅速简便地获得大量该蛋白，为新型的钩体疫苗研究奠定基础。
材料与方法
1. 菌株、质粒和试剂：钩体赖型017株由卫生部成都生物制品所提供，本室保存。宿主菌XL-1 Blue MRF和质粒pBK-CMV源于美国Strategene公司；宿主菌E.coli HB101、质粒pBV220由四川抗生素研究所提供；菌株E.coli DH5α为本室保存。PCR所用试剂为上海复华公司产品，各种核酸内切酶、修饰酶及地高辛标记检测药盒购自华美生物工程公司、Boehringer mannheim、Promega及BRL。
2. PCR引物：参照Shang等〔3〕报道的钩体L.alstoni株OmpL1基因的引物设计，略作修改。引物M1:5'-AAG GAG AAT TCA ATG ATC CGT AAC A-3', 引物M2:5'-TTG ATT GAA TTC TTA GAG TTC GTG TTT ATA-3', M1包含该基因的启始密码子，M2包含该基因的终止密码子，两引物各引入一个EcoRⅠ酶切位点。引物由美国Cybersyn公司合成。
3. 赖型017株钩体DNA的提取及纯化：参照Terpstra等〔4〕的方法，稍作修改。
4. 赖型017株OmpL1基因的扩增、电泳、回收及酶切：扩增条件为90℃、60℃、72℃各一分钟循环30次，首次循环90℃为3分钟，末次循环72℃为8分钟。产物回收后以EcoRⅠ酶消化。
5. OmpL1基因的克隆：将上述酶切后的PCR产物与用EcoRⅠ酶消化脱磷酸化后的pBK-CMV质粒混和，在T4 DNA连接酶作用下于4℃连接72小时，转化感受态宿主菌XL-1 Blue MRF'，铺于含有四环素和卡那霉素IPTG和X-Gal的LB平皿上，37℃培养过夜，挑取白色菌落移至含抗生素的LB液体培养基中培养增殖。以改进后的碱裂法快速提取质粒DNA，即集菌后加溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ处理，乙醇沉淀，RNase消化后以TE溶解。电泳初步判定质粒大小，符合要求者再用乙醇沉淀、洗涤，TE溶解后限制酶消化分析。
6. 重组质粒pBLM1的构建：从上述重组质粒中切下OmpL1基因片段，与另一载体质粒pBV220连接。连接条件同上。以限制酶消化分析和DNA杂交筛选鉴定出正向重组质粒，探针标记和杂交程序参照药盒说明进行，其余具体操作参照文献〔5〕。
7. 带正向重组质粒菌的热诱导表达及SDS-PAGE:热诱导培养参照文献〔6〕，SDS-PAGE的浓缩胶和分离胶浓度分别为5%和12%，方法参照文献〔5〕。
结 果
1. 017株钩体OmpL1基因的PCR克隆
(1) OmpL1基因的PCR扩增：以赖型017株钩体DNA为模板，用引物M1和M2扩增OmpL1基因，产生了大小约为1kb的特异产物带，与Haake等报道的OmpL1基因大小一致（见图1）。
图1 PCR扩增赖型017株钩体OmpL1基因片段
Fig 1.Amplified product of OmpL1 gene of L.serovar Lai strain 017 by PCR
1.λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ marker:21.2,5.1,4.9,4.2,3.5,2.0,1.9,1.5,1.3,0.94,0.83,0.56； 2.L.serovar Lai strain 017(1μl)；3,4.L.serovar Lai strain 017(1/10μl)；5,6.L.serovar Lai strain 017(1/100μl)；7,8.L.serovar Lai strain 017(1/1000μl)
(2) OmpL1基因与质粒pBK-CMV的重组：回收并以EcoRⅠ消化后的扩增产物与质粒pBK-CMV连接，转化铺皿后，得到多个白色菌落，提取质粒电泳酶切分析后得到重组质粒，暂命名为pCLM1。
2.质粒pBLM1的构建和鉴定
(1) 重组质粒pBLM1的构建：用EcoRⅠ酶从质粒pCLM1中将OmpL1基因片段切下，与用EcoRⅠ酶切，脱磷酸化后的质粒pBV220连接，构建重组质粒pBLM1（见图2）。
图2 pCLM1与pBLM1的构建
Fig 2. Construction of recombinant plasmid pCLM1 and plasmid pBLM1
P:PstⅠ;E:EcoRⅠ;CIP:Calf intestinal alkaline phosphatase
(2) 酶谱分析鉴定：用限制酶SmaⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ消化重组质粒电泳后显示出如下带型，SmaⅠ：一条带，4.6kb； EcoRⅠ：两条带，3.6kb+1kb；PstⅠ：三条带，3.9kb+0.5kb+0.2kb（见图3）。由于pBV220本身大小为3.6kb，SmaⅠ和EcoRⅠ消化的结果说明OmpL1基因已与pBV220重组，PstⅠ消化后仅得一种带型，经对照分析，确定筛选出的4个重组质粒均为正向重组子。
图3 OmpL1基因亚克隆后重组质粒的限制酶分析
Fig 3.Restriction enzyme analysis of recombinant plasmids after subcloning OmpL1 gene
A: 1.λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ marker； 2.Plasmid pBV220 digested by SmaⅠ； 3,4.Recombinant plasmid digested by EcoRⅠ
B：1.λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ marker；2-6. Recombinant plasmids digested by PstⅠ； *2-5:Sample with 5μl,6:Sample with 10μl
(3) 核酸杂交鉴定：用地高辛标记的017株钩体DNA扩增产物为探针，与质粒pBLM1杂交，设PCR产物、质粒pBV220、E.coli DH5α为对照，其中前两者出现强阳性信号，而后两者无任何信号出现，确证源于017株钩体DNA的OmpL1基因已插入质粒pBLM1中。
3.重组质粒pBLM1在E.coli DH5α中的表达：分别含有质粒pBLM1、pBV220及不含有任何质粒的菌株E.coli DH5α经热诱导生长4～6小时后，全菌蛋白提取物的SDS-PAGE显示（图4），4株带重组质粒菌中有一株在相对分子质量约33.5×103处出现一明显新带，其余所有菌株无该条带出现。
图4 亚克隆重组质粒表达产物的SDS-PAGE分析
Fig 4. Analysis of expression of recombinant plasmids after subcloning OmpL1 gene by SDS-PAGE
1.Protein molecular weight marker； 2,3.E.coli DH5α-recombinant plasmid；4.E.coli DH5α； 5,6.E.coli DH5α-pBV220； 7,8.E.coli DH5α-recombinant plasmid
讨 论
钩体外膜蛋白在钩体疫苗研究中具有重要用途，但在钩体中这种蛋白含量少，且脆性大，直接提取困难而繁琐，如果能将外膜蛋白基因克隆入表达型质粒载体，就可以简便迅速地得到大量天然蛋白。由于OmpL1外膜蛋白基因的序列已全部测出并Southern杂交证明其存在于017株钩体中〔7〕，所以本研究就采用了PCR克隆方法快速克隆到017株的该基因，进而构建了表达OmpL1蛋白的重组质粒pBLM1。
质粒pBV220是一个在原核细胞表达天然蛋白的克隆表达质粒，其启动子为PRPL串联强启动子，由Cits857调控系统控制在42℃以上热诱导表达〔8〕。pBV220是国内研制的较成熟又应用较广的质粒之一，迄今已用它成功地表达了多种天然蛋白。但作为克隆质粒，其弊端之一在于无颜色筛选标志，造成筛选工作量加大。而PCR克隆本身在实际操作中又存在一定难度，需要反复优化各种反应条件。为此，我们首先选用了具有颜色筛选标志的pBK-CMV质粒为PCR克隆质粒。该质粒的这种用颜色使重组子泾渭分明的特性使得初筛工作量较只能靠酶切电泳进行初筛的pBV220大大减少，而一旦将OmpL1基因重组入pBK-CMV后，就可以直接从重组质粒中切下OmpL1基因片段再克隆至pBV220，这比用PCR产物来克隆要容易得多。而且，与pBK-CMV重组后的质粒在以后钩体的核酸疫苗研究中还将有重要用途。
重组质粒pBLM1在宿主菌E.coli DH5α中经热诱导后表达出一相对分子质量约为33.5×103的新蛋白，与Haake等报道的OmpL1蛋白大小一致，说明我们用PCR扩增获取的钩体017株OmpL1基因具有完整的阅读框架。表达的蛋白可有以下用途：①作为基因工程蛋白疫苗进行动物实验研究；②在体外研究该蛋白的结构、性质和功能；③作为抗原来测定动物实验中的抗体水平。因此，pBLM1表达质粒的构建和表达成功，为研制新型的钩体疫苗奠定了坚实的基础。
本课题受国家自然科学基金（39500006）和高校博士点基金资助
参考文献
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[3]Shang ES, Exer MM, Summers TA, et al. The rare outer membrane protein, OmpL1, of pathogenic Leptospira species is a heat modified porin. Infection and Immunity, 1995,63(8)∶3174-3181.
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(收稿：1997-11-24 修回：1998-03-16)