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登革病毒E蛋白区段基因克隆及高效表达
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第4期第19卷 病毒学
作者：郭庆福 詹轶群 逯好英 周洁 李胜华 梁小兵
单位：100850 北京，军事医学科学院微生物流行病研究所(郭庆福 詹轶群 周洁 李胜华 梁小兵)；基础医学研究所(逯好英)
关键词：登革病毒；E蛋白区段；基因表达；抗原；病毒
【 摘要 】 目的 进行登革病毒E蛋白区段的高效表达，制备抗原，为分析T、B细胞表位及免疫功能的研究奠定基础。方法 以含有D2V E区的质粒p30.VD2为模板，PCR扩增了编码D2V E蛋白308～468aa区段的基因片段,以pMY为表达载体，构建了表达质粒pDE1,并用酶切法使之缺失跨膜区疏水aa较多的编码序列，又构建了表达质粒pDE2,分别转化大肠杆菌，获得了不同的工程菌株。经诱导培养，SDS-PAGE，免疫印迹及酶联检测分析表达产物。结果 含pDE1质粒工程株只能表达微量的特异性蛋白;而含pDE2质粒的工程菌株则能高效表达D2V特异性E蛋白，重组表达产物占菌体蛋白的25.31%。用4mol/L尿素溶解包涵体，上清中E蛋白纯度可达80％。以粗提物包板进行酶联检测，结果表明,该重组E蛋白具有DV 4个型交叉抗原的特性。结论 缺失C末端疏水区编码序列的D2V E基因片段，可在E.coli中获得高效表达，其表达产物具有DV属特异性。
High level expression of D2V E gene fragment in E. coli and analysis of expression product GUO Qingfu*, ZHAN Yiqun, LU Haoying, et al. * Institute of Microbiology Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850
【 Abstract 】 Objective In order to obtain the product of D2V E gene fragment for establishing the basis to analyse the epitopes and functions of T and B cells, the high level expression of the gene fragment in E. coli was studied.Methods The gene fragment coding for 308-468aa of envelope (D2V E) protein of Dengue-2 virus was cloned with PCR method from p30VD2 plasmid and inserted into pMY vector with PL promoter. The recombinant plasmid was transformed into E. coli cells and the expressed products were analyzed with SDS-PAGE and Western blotting.Results High level expression was performed by truncating coding region for the hydrophobic carboxyterminus of the D2V E protein. The expressed product of the gene fragment could amount to 25.31% of the total bacterial protein. The product was in the form of inclusion bodies and could be solubilized in 4mol/L urea and served as antigen to coat microtitre plates for detection of anti-DV antibodies. The results showed that the recombinant protein reacted with antibodies from mice immunized with DV 1-4 type.Conclusions This study suggests that the gene fragment lacking the sequences coding for the hydrophobic carboxyterminus of the D2V E protein be expressed efficiently in E. coli system and the expressed products react with antibodies from mice immunized with DV 1-4 type.
【 Subject words 】 Dengue virus E protein fragment Gene expression Antigen,viral
由登革病毒（DV）引起的急性传染病登革热,通过蚊虫传播流行，人普遍易感。部分患者可出现严重的登革出血热或登革休克综合症（DHF／DSS），死亡率较高。此病世界范围流行，主要在东南亚地区。我国海南、广西等地曾流行过多次。对DHF／DSS的发病机理进行研究证明：中和剂量的抗体(Ab)可起免疫保护作用，而异型Ab或亚中和剂量的Ab却起增强感染作用〔1，2〕。利用单克隆抗体和分子生物学技术研究证明,保护性Ab和增强性Ab是由不同的抗原决定簇产生的〔3-5〕,但这些决定簇至今尚不清楚，给疫苗的研制带来了困难。通过对DV抗原表位的分析，寻找只产生保护性Ab不产生增强感染的Ab，又能激活抗病毒感染必需的特异性细胞免疫的重组抗原，是目前DV疫苗研究的热点。进一步研究表明DV的E蛋白基因具有高度保守的序列，既含有中和Ab的B细胞表位〔6〕，又含有T细胞的表位〔7〕。1992年Megret等所得到的保护性IgG识别的表位都在E蛋白的290～400aa区段的位置〔8〕。1996年Rothman等证明E蛋白的331～339aa的区段中含有特异性CD4+和CD8+杀伤T细胞的表位〔9〕。以上研究表明在DV E蛋白的290～400aa序列中可能既含产生特异保护性Ab的B细胞表位，又含特异性杀伤T细胞的表位，可成为研制疫苗的候选蛋白区段。本研究目的在于利用重组DNA技术研制该蛋白区段内重组抗原,为免疫学分析创造条件。
材料与方法
1.菌种：E.coli HB101 ,E.coli BL-21本院基础医学研究所分子遗传室提供。
2.质粒:p30.VD2含D2V E蛋白基因片段,巴斯德研究所Deubel教授〔10〕惠赠。pMY表达质粒,本院基础医学研究所分子遗传室提供。
3.酶：EcoRⅠ、ClaⅠ、BamHⅠ、Taq、T4 DNA连接酶等均购自华美公司。
4.抗体:鼠抗D2V腹水1～4型；D2V单抗;酶标羊抗鼠IgG；本室制备。
5.质粒提取、酶切、连接、转化、蛋白电泳和免疫转印：皆参考《分子克隆实验指南》〔11〕 进行。
6.引物:参考Menbl分析的D2V E区氨基酸序列〔12〕 设计了一对引物,本院放射医学研究所合成其核苷酸序列如下：
正向：5＇CCGAATTCTGTGAAGGAAATA
GC；
反向：5＇GGATGGATTCCTATCCATGTG。
7.PCR扩增:用上述引物以p30 VD2质粒为模板，97℃ 10分钟处理后，按94℃ 70秒，53℃ 80秒，72℃ 120秒经30个循环扩增后，72℃反应7分钟取样检查。
8.酶联检测：以初步纯化的重组蛋白包板，按常规方法进行酶联检测。
结 果
1.PCR扩增结果：按上述条件PCR扩增出488bp的片段，其大小与预期结果相符。
2.表达质粒pDE1构建：用EcoRⅠ和ClaⅠ酶切质粒pMY及PCR扩增片段,电泳回收4.4kb的pMY线性DNA和0.5kb 扩增的E基因片段，用T4 DNA酶连接,获得了4.9kb重组表达质粒pDE1(图1)。
图1 D2V E蛋白基因表达质粒pDE1和pDE2的构建
Fig 1. Construction of the plasmids pDE1 and pDE2 for the expression of D2V E
3.重组转化子鉴定：将表达质粒转化感受态大肠杆菌HB101，培养后挑转化子，提取质粒DNA,经鉴定大于载体质粒DNA。以转化子质粒为模板,用原引物作PCR扩增,仍能得到488 bp的扩增带(图2)，提取转化DNA用E.coRⅠ 和ClaⅠ也可切出一个488 bp的片段。
图2 以转化质粒为模板PCR扩增产物
Fig 2. PCR product from pDE1
1～3.pDE,4.pMY,5.Marker
4.表达产物鉴定:将工程菌过夜培养物接种LB培养基30℃培养3小时,42℃诱导3.5小时,离心收集菌体并经裂解处理后进行SDS电泳,可见在相对分子质量18×103处多出一条带，经免疫印迹证明是DV特异的蛋白带，但表达甚微。
5.工程菌的表达质粒pDE2构建:用BamHⅠ酶切去跨膜区424～468aa的编码序列，回收大片段进行环化,重新构建表达质粒pDE2,转化E.coli BL21感受态菌，经鉴定,DNA大小和酶切片段的大小与理论值相符。重建后的工程菌,用同样条件培养诱导后SDS电泳结果表明,有一明显可见的重组产物带(相对分子质量约17×103),经扫描检测,表达产物占菌体蛋白的25.31%，初步纯化结果表明,表达产物主要以包涵体形式存在。用4mol/L尿素溶解包涵体,离心上清中E蛋白的纯度在80%以上(图3)。
图3 pDE2/BL-21工程菌表达的D2V E蛋白的SDS-PAGE
Fig 3. SDS-PAGE of D2V E protein expressed from pDE2/BL-21
1.D2V E protein extracted in 4mol/L urea; 2.pMY/BL-21 lysate; 3.pDE2/BL-21 lysate; 4.MW marker
6.抗原性分析:粗制重组蛋白包板,经酶联检测能与1～4型DV 抗体反应(表1)，说明该蛋白是DV属特异性抗原。
表1 D2V E抗原与1～4型DV抗体的反应
Table 1. D2V E Ag reaction to 1～4 type DV Ab
| Ab type | Ab of different dilution | |||||||||
| 1∶10 | 1∶20 | 1∶40 | 1∶80 | 1∶160 | 1∶320 | 1∶640 | 1∶1280 | 1∶2560 | control | |
| D1V | 0.64 | 0.60 | 0.53 | 0.43 | 0.33 | 0.22 | 0.18 | 0.09 | 0.06 | 0.01 |
| D2V | 0.46 | 0.38 | 0.30 | 0.19 | 0.14 | 0.09 | 0.05 | 0.04 | 0.03 | 0.01 |
| D3V | 0.62 | 0.58 | 0.51 | 0.47 | 0.39 | 0.30 | 0.21 | 0.11 | 0.06 | 0.01 |
| D4V | 0.56 | 0.51 | 0.45 | 0.36 | 0.28 | 0.21 | 0.13 | 0.08 | 0.06 | 0.01 |
| Normal ascites | 0.21 | 0.16 | 0.14 | 0.09 | 0.07 | 0.07 | 0.05 | 0.04 | 0.02 | 0.02 |
Dilution of D2V E Ag:1∶100
讨 论
根据Mandl对黄病毒属中森林脑炎病毒(TBE)E蛋白抗原结构域的分析并依据两亲性α-螺旋结构推测的T细胞表位的位置,我们设计并合成了一对引物,以质粒p30VD2为模板,PCR扩增得到了488bp的基因片段,构建了表达质粒,转化大肠杆菌获得了工程菌株,但表达甚微。经分析去掉了疏水性aa较多的跨膜区的编码序列,重新构建了表达质粒pDE2转化大肠杆菌BL21,获得高效表达工程菌株。由此可见,跨膜区疏水区段编码序列的存在与否,对DV E蛋白区段在大肠杆菌中的表达有明显影响。其原因可能是跨膜区疏水区的存在使E蛋白易与细胞膜结合,从而影响了细菌的正常生理功能,致使表达明显下降,此问题有待进一步分析。
抗原性分析结果表明所表达的D2V的E蛋白区段可与其它3型DV的抗体交叉,证明此蛋白区段含DV属特异性抗原表位。Leclerc C等报道DV的E蛋白397～413aa肽段的同源性高达81%〔13〕。同源性越高作为4型共同亚单位疫苗的可能性越大。表达的E蛋白与1～4型DV抗体酶检测中本应与2型抗体反应最强,但实验中与2型抗体反应最弱,原因是2型抗体效价低于其余3型。另外,由于酶联检测用的是粗制重组蛋白,本底较高,还需要进一步纯化与改进。本研究获得了D2V E蛋白高效表达的工程菌株,制备了重组E抗原,为T、B细胞表位的分析及其免疫功能的研究奠定了基础。
本课题受军事医学科学院科研基金资助
参考文献
1 Halstead SB. Comparison of p388 D1 mouse macrophage cell line and human monocytes for assay of dengue 2 infection enhancing antibodies. Am J Trop Med Hyg, 1983, 32∶157-163.
2 Halstead SB,Rojanasuphot S, Sangkawibha N,et al.Original antigenic sin in dengue. Am J Trop Med Hyg, 1983, 32∶154-156.
3 Halstead SB. Pathogenesis of dengue: challenges to molecular biology. Science,1988,239∶476-481.
4 Halstead SB. Heterogeneity of infection enhancement of dengue 2 strains by monoclonal antibodies. J Immunol,1984,132∶1529-1532.
5 Henchal EA, McCown JM,Burke DJ,et al.Epitopicanalysis of antigenic determinants on the surface of dengue-2 virions using monoclonal antibodies.Am J Trop Med Hyg，1985, 34∶162-169.
6 Brand WE. Development of dengue and Japanese encephalitis vaccines.J Inf Dis，1990,162∶577-583.
7 Livingston PG,Kurane I,Ennis F.Recognition of envelope protein by dengue virus serotype-specific human CD4+ CD8- cytotoxic T-cell clones. J Virol，1994,68∶3283-3288.
8 Megret F,Hugno JP,Falconar A,et al.Use of recombinant fusion proteins and monoclonal antibodies to define linear and discontinuous antigenic sites on the dengue virus envelope glycoprotein.Virology ,1992,189∶480-491.
9 Rothman AL , Kurane L, Ennis F, et al.Multiple specificities in the murine CD4+ and CD8+ T-cell response to Dengue virus. J Virol, 1996,70∶6540-6546.
10 Deubel V,Kinney RM ，Trent DW.Nucleotide sequence and deduced amino-acid sequence of the structural proteins of dengue 2 virus Jamaica genotype.Virology， 1986, 155∶365-377.
11 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T,著. 金冬雁,黎孟枫,等译.分子克隆实验指南.第二版,北京:科学出版社,1993.
12 Mandl CW, Guirakhoo F, Holzmann H, et al. Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level,using tick-borne encephalitis virus as a model.J Virol，1989,63∶564-571.
13 Leclerc C,Derlaud E,Megret E, et al.Identification of helper T cell epitopes of dengue virus E-protein.Molecular Immunology， 1993,30∶613-625.
(收稿：1998-03-09 修回：1998-08-12)