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用核酸序列分析鉴别甲肝病毒疫苗株与野毒株
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第3期第19卷 疫苗学
作者：周德久 黄小琴 白惠珠 曹逸云 董德祥
单位：650107 昆明市，中国医学科学院 中国协和医科大学 医学生物学研究所
关键词：甲肝减毒活疫苗；核苷酸序列；诊断；鉴别
【 摘要 】 目的 鉴别在接种甲肝减毒活疫苗(H2株)后23天发生的一例甲型肝炎，其病原体是疫苗株还是野毒株。方法 用细胞培养、IEM等确认病原体，接种普通狨猴检定病毒毒力，测定核苷酸序列分析病毒基因型。结果 甲型肝炎的确诊依据有：抗IgM(+)，双份血清HAV总抗体效价16倍增长以及粪便排出HAV(郑株)。该粪便悬液攻击普通狨猴后，肝脏呈现持续性组织病理改变，证明郑株是强毒HAV。郑株的3个片段共1 377个核苷酸序列分析表明，与1988年上海甲肝流行株合-52的同源性高达(98.30～99.40)%，判定为IA基因亚型，与H2株疫苗病毒的基因亚型不同。结论 该例甲型肝炎是接种甲肝减毒活疫苗中交叉感染野毒株引发的偶合病例，与疫苗接种无关。
Nucleotide sequence analysis used in distinguishing vaccine strain from wild strain of HAV
ZHOU Dejiu, HUANG Xiaoqin, BAI Huizhu, et al. Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Sciences/Peking Union Medical College, Kunming 650107【 Abstract 】 Objective To distinguish whether the etiologic agent was the vaccine strain or wild strain of HAV for vaccine Zheng who suffered from hepatitis A on day 23 after inoculation with the live attenuated hepatitis A vaccine, H2 strain.Methods Cell cultivation and IEM were used for confirming the etiologic agent, common marmosets were challenged for identifying the virulence of HAV and nucleotide sequence was determined for analyzing the genotype of HAV.Results The evidences for diagnosis of hepatitis A were: anti HAV IgM(+), 16-fold rise of anti HAV titer in paired sera and HAV (Zheng strain) shedding in feces. The liver of common marmosets challenged with the positive fecal suspension revealed persistent histo-pathologic changes, Thus the virulence of Zheng strain was demonstrated. Three fragments of 1 377 nucleotides, of which 467 bases (47-513) at the 5' end of genome and 910 bases (2 447-3 356) including 168 bases (3 024-3 191) at the joint site of P1 and P2 genus for genotyping have been sequenced for Zheng strain. The homology rate of Zheng strain with He-52 strain, a wild HAV strain recovered during Shanghai epidemic of hepatitis A in 1988, was significantly higher (98.3-99.4)% than with H2 vaccine viruses (90-94.9)%. Zheng strain was classified into IA subgenotype which was different from the subgenotype IB of H2 vaccine viruses.Conclusions The hepatitis A of Zheng was a coincidental case not related to vaccination but caused by cross infection with wild strain of HAV during inoculation of live attenuated hepatitis A vaccine.
【 Subject words 】 Live attenuated hepatitis A vaccine Nucleotide sequence Diagnosis，differential
甲肝减毒活疫苗应用至今7年，已在一亿多人体中进行免疫接种。不少报道〔1-3〕均证明该疫苗是安全有效的。我们在1993年获悉一例接种甲肝减毒活疫苗(H2株)后23天发病的甲肝患者，当时无条件区别是接种疫苗引起的相关病例，还是甲肝野毒株交叉感染导致的偶合病例。1996年经对该患者粪便排出病毒进行若干片段核苷酸序列测定，确认病原体为甲肝病毒IA基因亚型，该患者是甲肝病毒野毒株引发的偶合病例。现将结果报告如下：
材料与方法
1.病例情况：患者郑××，男，10岁，小学生。1993年5月24日接种甲肝减毒活疫苗(H2株，批号930219)1人份剂量。6月16日，即接种疫苗后23天因发热、皮肤发黄前往昆明市延安医院就诊。当时检查：体温38.4℃，ALT 150U/L；一周后复查：ALT升至600U/L，抗HAV IgM(+),HBsAg(-),抗HCV(-)；半月内双份血HAV总抗体从40EU上升至640EU，诊断为急性甲型肝炎。
2.标本：1)郑××病程1、8、15天静脉血3份，分离血清备检；2)郑××病程10天粪便1份，用PBS制成20%悬液，-30℃冻存备用；3)上海1988年甲肝大流行期间采集并冻存于-30℃的患者合-52的20%粪便悬液(合-52株)。粪便悬液经3次氯仿抽提，用PEG-6000作10倍浓缩制成粪便提取液。4)H2株甲肝减毒活疫苗成品(K7)，用PEG-6000作10倍浓缩备用。
3.普通狨猴：购自天津医科大学实验动物中心，公母各一，编号103，106，猴龄2～3岁，体重260～350克。感染前经检测血清抗-HAV阴性，ALT、AST、ICD等肝脏酶活性和肝组织病理检查均正常。该品系狨猴对甲肝病毒感染的敏感性高，是研究甲肝病毒可靠动物模型〔4〕。
4.核苷酸序列测定：全部实验从病毒RNA提取至测序分析均在日本国立预防卫生研究所户冢敦子博士指导下完成。按文献〔5〕的方法提取病毒RNA，用ABI各种试剂盒和377自动测序仪进行逆转录、cDNA扩增、纯化和核苷酸测序，用计算机软件(自动测序携带的)序列分析版本2.1进行结果分析。
(1)引物名称(极性)、在基因组中的位置和5～3序列：P30HM(+)，30～49，GTCCCTCTTGGAAGTCCATG；N17(-)，516～535，GAGTAGGTCACCTACGTAAC；P2 427(+)，2 427～2 446，GGAGAATCCAGACATACATC；N3 359(-)，3 358～3 381，CTTCACACACCTGAGAACTTTACC。
(2)K7疫苗病毒核苷酸全序列测定结果表明，K7疫苗病毒的全基因组由7 473个核苷酸组成。K7疫苗病毒与其种子病毒H2减毒株〔6〕、HM175减毒株和HM175野毒株的全序列同源性分别为99.75%、99.95%和99.61%；在区分基因型的关键片段，即P1-P2连接处的168个碱基序列〔7〕同源性也高达99.40%，100%和99.40%，证明K7疫苗病毒属IB基因亚型〔8〕。
结果与讨论
1.确诊患者为甲肝病例：3份血清用酶免疫法检测，抗HAV IgM效价高达20000EU，抗HAV效价较高，在2周中由40EU升高至640EU，呈16倍增长。粪便悬液经适当处理后进行细胞培养分离，结果证明含有甲肝病毒；粪便提取液用IEM检查到成簇甲肝病毒，病毒间有明显抗体桥连接。根据以上特异性阳性结果，结合ALT异常升高而临床病程短、预后良好，确诊患者为甲肝病例。
2.患者粪便中HAV(郑株)的毒力检测：20%粪便悬液经适当处理后用于静脉注射2只普通狨猴，每只1ml。12周观察期内，每周静脉采血，检测血清抗-HAV抗体。2只狨猴抗HAV抗体于感染后2周阳转，12周效价达1 024和2 048；共检测2只狨猴三项血清酶30次，未发现异常升高。每只狨猴感染后4、8周进行肝穿，12周处死尸检，观察肝组织病理改变，结果发现2只狨猴均呈现持续一个月以上的肝脏实质区炎性浸润和明显的汇管区单核细胞浸润，按Krawczynski等〔9〕分度标准判为++和+++。以上狨猴试验结果与本实验室用合-52野毒株攻击普通狨猴结果基本一致，而与用K7疫苗病毒接种普通狨猴结果截然不同〔4〕，证明郑株为甲肝病毒强毒株。
3.郑株、合-52株、K7疫苗的核苷酸序列比较：测定了有三个代表性的核苷酸片段序列，3株病毒的同源性比较见表1。结果表明郑株与合-52株在三个片段同源性均明显高于与K7疫苗病毒的同源性。特别在区分基因型的168个核苷酸片段，郑株与合-52株的同源性高达99.4%，属同一基因亚型，而郑株与K7疫苗病毒的同源性仅90.5%，属不同基因亚型。进一步与GBM、PRC-37株的168个核苷酸序列比较，郑株的同源性为96.4%和99.4%，合-52株的同源性为95.8%和98.8%，证实了郑株与合-52株均属IA基因亚型。
表1 郑株与合-52株、K7疫苗病毒三个片段的核苷酸同源性比较
Table 1. Homology comparison at three fragments of nucleotide acid of Zheng strain with He-52 strain and K7 vaccine virus
| Site of bases | He52 | K7 |
| 5467 basws (47-513) | 98.3 | 94.9 |
| P1 to P2 168 bases (3024-3191) | 99.4 | 90.5 |
| 910 bases (2427-3556) | 98.8 | 90.0 |
综上结果说明：郑××于接种甲肝减毒活疫苗后23天罹患的甲型肝炎是由甲肝病毒强毒株引起的，可以排除患者免疫功能低下导致甲肝减毒活疫苗致病的可能性。要进一步鉴别诊断此强毒病原体是减毒活疫苗病毒的毒力返祖后代，还是野型病毒，则需通过基因型鉴别。我国流行的甲肝病毒主要为IA基因亚型。毛江森实验室比较了H2减毒株与HM75减毒株、野毒株的核苷酸全序列〔6〕，我们测定了用H2株生产K7疫苗的全序列，结果与之吻合。郑××接种的H2株甲肝活疫苗为IB基因亚型，而罹患的甲型肝炎，其病原体为IA基因亚型，因而可以结论：郑××为一例接种甲肝活疫苗中发生的偶合病例，所患甲型肝炎与疫苗接种无关。志谢：本文中的核苷酸序列测定工作是在日本国立预防卫生研究所户冢敦子博士实验室及其指导下完成，特此致谢。
本课题受美国中华医学基金会(CMB)资助(93-582)
参考文献
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2 徐志一，李成荣，孟宗达，等.甲型肝炎减毒活疫苗免疫原性和保护效果的初步观察.中华医学杂志，1998，78∶254-256.
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4 练幼辉，曹逸云，黄小琴，等.甲型肝炎病毒动物模型研究.现代预防医学，1997，24∶303-305.
5 萨姆布鲁克J，等.分子克隆实验指南.第二版，北京：科学出版社，1992，P352-356.
6 陈勇，柴少爱，洪艳，等.甲肝病毒减毒活疫苗(H2株)的cDNA克隆及序列分析.浙江省医学科学院学报，1995，6∶3-14.
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(收稿：1998-07-23 修回：1998-10-22)