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人血小板生成素在重组痘苗病毒中的分泌表达
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第4期第19卷 细胞因子
作者：魏博 杨洁 刘文军 张玉倩 阮力
单位：100052 北京，中国预防医学科学院病毒学研究所遗传室
关键词：人血小板生成素；重组痘苗病毒；基因表达
【 摘要 】 目的 研究人血小板生成素(hTPO)在重组痘苗病毒中的表达。方法 以PCR法从人胚肝cDNA文库中克隆完整的hTPO基因， 将所克隆基因插入痘苗病毒表达质粒pJSA1175SmaⅠ位点，置于7.5K启动子控制之下，并构建在349位氨基酸变异与非变异的两种TPO重组痘苗病毒。以Dot-ELISA法和促TPO依赖细胞增殖的活性测定，进行表达产物的检测。结果 研究证实：hTPO可分泌性的表达于重组痘苗病毒感染细胞上清中，并具有特异性的生物学活性。结论 hTPO在重组痘苗病毒中的表达为TPO结构与功能研究提供了一条新途径。
Secreting expression of human thrombopoietin in recombinant vaccinia viruses WEI Bo, YANG Jie, LIU Wenjun, et al. Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052
【 Abstract 】 Objective To study the expression of human thrombopoietin(hTPO) in recombinant vaccinia viruses.Methods The intact hTPO gene was cloned from a human embryo liver cDNA library with PCR. Two of cloned genes were inserted at Sma Ⅰ site of pJSA1175 expression vector under the control of 7.5K promoter and the recombinant plasmids were subsequently used to construct recombinant vaccinia viruses. The rhTPO expressed from vaccinia recombinants were detected with Dot-ELISA and the bioassay using an engineered TPO dependent cell line.Results It was confirmed by immunoassay and bioassay that rhTPO expressed in vaccinia recombinants infected cells could be secreted into the culture medium with specific biological activity.Conclusion This work has provided a new approach to study the structure and function of hTPO.
【 Subject words 】 Human thrombopoietin Recombinant vaccinia virus Gene expression
血小板生成素(TPO)是通过刺激巨核细胞增殖、分化及成熟，从而调节体内血小板生成的主要生理性调节因子。它早已得到一些血液学学者的关注， 但早期的研究因受限于从含量甚微的生物样品中提纯、制备TPO的困难而久无重大突破。自1994年TPO基因成功克隆以来〔1-4〕， 有关TPO的研究便成为细胞因子研究领域的又一热点。
应用痘苗病毒载体表达细胞因子或其相应受体进行细胞因子生物学方面的研究，国内外均有报道〔5-8〕。 重组痘苗病毒系统是目前较为成熟的一种真核表达系统，它具有表达效率高、遗传操作简便的特点，其表达产物可被有效糖基化，较原核及酵母系统表达产物更接近于天然。TPO基因在重组痘苗病毒中的表达，将可能获得在高级结构、理化特性和生物学功能上更接近于天然TPO的表达产物， 从而为今后TPO分子生物学方面的研究奠定基础，同时,为TPO结构与功能研究提供一条新的途径。
迄今为止，尚未有TPO基因在重组痘苗病毒系统中表达的报告，考虑到完整的TPO是高度糖基化的蛋白质，结合痘苗病毒表达系统特点，我们构建了TPO重组痘苗病毒，使完整的hTPO编码基因得以在痘苗病毒表达系统中分泌表达。
材料与方法
1.cDNA文库、质粒和菌株：人胚肝cDNA文库由上海细胞生物学研究所裴钢教授惠赠。pJSA1175质粒由本室构建；pUC18克隆质粒、M13mp18RF、M13mp19 RF测序用质粒购自华美生物工程公司。大肠杆菌MC1061、JM109菌株由本室保存。
2.病毒和细胞：天坛株痘苗病毒和Tk-143细胞由本室保存。
3.工具酶和试剂：常用限制性内切酶购自华美生物工程公司。T4 DNA连接酶、Vent DNA聚合酶购自Promega和Biolab's公司，T7 DNA测序试剂盒购自Pharmacia公司，α-35S购自Amersham公司。地高辛标记及检测试剂盒为B&M公司产品，Lipofectin为Gibco BRL公司产品。杆状病毒表达rhTPO及抗rhTPO抗体为R&D公司产品。其它试剂为国产或进口分析纯。
4.引物设计、hTPO全基因的克隆及序列测定：参考已报告hTPO序列，辅以计算机分析，合成两对引物（中国科学院微生物学研究所合成），分段克隆hTPO全序列。 P1:5＇-CGGAATTCCAGAATGGA
GCTGACT-3＇; P2: 5＇-TTGTGAGCTGTGGTCC
T-3＇; P3:5＇-GACAGAATTCATGAGCCCGGCT
CCTCCTGCTTGT-3＇；P4:5＇-GACGAAGCTTACCCTTCCTGAGA-3＇;P1、P2用于克隆包括信号肽编码序列在内的hTPO 5＇端428个核苷酸基因片段，P3、P4用于克隆信号肽编码区后、自22位氨基酸至终止密码子间的基因片段，并加入EcoRⅠ位点和起始密码子ATG，便于PCR产物克隆和可能的原核表达实验。两片段通过共有的PstⅠ位点相连接，构成带信号肽编码序列、适合真核系统分泌表达的hTPO完整基因。 将完整的hTPO基因通过加入其两端的EcoRⅠ和HindⅢ位点，克隆于pUC18载体， 同时克隆于 M13mp18和M13mp19载体中。按《分子克隆实验指南》介绍方法，制备单链DNA，以双脱氧终止法进行测序反应，测定所克隆hTPO基因序列。
5.pJSA1175-TPO重组表达载体的构建：pJSA1175质粒带11K和7.5K启动子，其旁侧为痘苗病毒TK区左右两端同源序列。11K启动子携带LacZ基因，将克隆的hTPO基因插入7.5K启动子下游SmaⅠ位点，构成pJSA1175-TPO重组质粒，用于TPO重组痘苗病毒的构建。
6.TPO重组痘苗病毒的构建和鉴定：按本室常规，采用脂质体转染技术，将pJSA1175-TPO重组质粒导入预先感染天坛株痘苗病毒的Tk-143细胞。通过加BrdU(25μg/ml) 和以含X-gal(200μg/ml)中性红的营养琼脂铺斑双重选择，挑取Tk-重组蓝斑病毒，并连续挑斑纯化3代。提取重组痘苗病毒DNA,分别以PCR法及Southern blot,鉴定TPO重组痘苗病毒，证实目的基因的整合。
7.rhTPO表达产物的免疫检测：以10 PFU/cell病毒量,分别接种TPO重组痘苗病毒及非重组痘苗病毒于培养成片的143细胞，加无血清Eagle's培养液维持培养。24小时后，收获培养上清，以0.22μm滤膜过滤，除去细胞残渣。过滤后上清点样于硝酸纤维素膜(NC)上，以3%BSA封闭，依次加抗rhTPO抗体及酶标二抗，进行Dot-ELISA检测。
8.表达产物的活性测定：免疫检测用相同样品进行促TPO依赖工程细胞增殖活性的检测。BAF/mpl细胞系以基因工程技术构建的导入TPO受体基因mpl的TPO依赖细胞，其生长依赖于TPO活性蛋白，将依赖细胞以(1～1.5)×104cells/60μl量接种于含5倍系列稀释待检样品及阳性对照的96孔板中，置37℃、5% CO2培养48小时后，以MTS法进行显色，测定492nm吸光度(A)值。
结 果
1.rhTPO全基因的克隆及序列测定：按预期设计结果，以PCR方法，由人胚肝cDNA文库中成功克隆出大小分别约为0.44 kb和1.0kb的片段（见图1）。经酶切、连接，克隆于pUC18载体。双脱氧终止法测序结果表明：与已报告序列比较，所克隆hTPO基因在639位和1044～1046位发生突变，其中639位和1044位的突变未影响氨基酸编码，而1045位(C→T)和1046位(T→C)的突变（见图2A）使第349位氨基酸由Leu变为Ser,这一突变恰好位于TPO第6个糖基化位点上。为防止其可能对TPO蛋白结构造成影响，以定点诱变法，将突变的349位Ser修正为Leu。
图1 PCR产物凝胶电泳图
Fig 1. Electrophoresis of PCR products of hTPO cDNA fragments
a.DNA MW standard: λDNA/ EcoRⅠ+HindⅢ；b.hTPO fragment amplified by P1，P2；c.hTPO fragment amplified by P3，P4
图2 pJSA1175-TPO重组质粒的构建
Fig 2. Construction of pJSA1175-TPO plasmid
2.TPO重组痘苗病毒的构建及鉴定：克隆并测序证实，第349位氨基酸变异与非变异的hTPO基因（TPOⅠ和Ⅱ),均用于构建pJSA1175-TPO重组表达质粒，重组质粒构建及酶切鉴定见图2、图3。将重组质粒导入预先感染了痘苗病毒的TK-143细胞后，获得TPO重组痘苗病毒Ⅰ和Ⅱ。以引物P1和P4进行PCR反应，由TPO重组痘苗病毒DNA中可检出全长TPO基因片段，表明TPO基因完整地存在于重组痘苗病毒中。以地高辛标记TPO基因片段为探针，进一步以Southern blot鉴定确证了TPO重组痘苗病毒(见图4)。
图3 pJSA1175-TPO重组质粒酶切鉴定
Fig 3. Identification of pJSA1175-TPO by restriction analysis
1. pJSA1175/PstⅠ；2. pJSA1175-TPO/PstⅠ；3. pJSA1175-TPO(reverse inserted)/PstⅠ；4. λDNA/HindⅢ marker；5. pJSA1175/PvuⅡ；6. pJSA1175-TPO/PvuⅡ；7. pJSA1175/XhoⅠ；8. pJSA1175-TPO/XhoⅠ
图4 TPO重组痘苗病毒Southern blot鉴定结果
Fig 4. Identification of TPO recombinant vaccinia virus by Southern blot
A. Map of electrophoresis before hybridization
B. Map of hybridization with TPO probe
1. pUC18-TPO/ EcoRⅠ+PstⅠ； 2. Viral DNA from TPO recombinants/ HindⅢ； 3. Viral DNA from non-recombinants/ HindⅢ； 4. λDNA/ HindⅢ marker
3.重组痘苗病毒感染上清中rhTPO的免疫检测：以正常143细胞培养上清及非重组痘苗病毒无血清感染上清为阴性对照，以10ng，25ng，50ng rhTPO为阳性对照，分别以50μl，150μl，300μl点TPO重组痘苗病毒无血清感染上清和对照样品于NC膜上。Dot-ELISA检测结果表明： TPO重组痘苗病毒感染上清中可检出hTPO的表达（见图5）。在349位氨基酸变异与非变异的2种重组痘苗病毒感染上清中，以免疫酶学方法检测hTPO的表达无明显差异。
图5 TPO重组痘苗病毒感染上清的Dot-ELISA检测
Fig 5. Detection of hTPO in culture medium of TPO recombinant vaccinia virus infected cells by Dot-ELISA
1.Culture medium of TPO recombinant virus Ⅰinfected cells；2.Culture medium of non-recombinant virus infected cells；3.Culture medium of TPO recombinant virusⅡ infected cells；4.Culture medium of 143 cells；5.Eagle's culture medium；6.hTPO positive control (10ng， 25ng， 50ng)
a. Dot with 50μl sample；b. Dot with 150μl sample；c. Dot with 300μl sample
4.重组痘苗病毒表达rhTPO的活性测定:应用TPO依赖工程细胞株，检测重组痘苗病毒感染上清中促依赖细胞增殖活性。结果表明：仅在重组病毒感染上清中可检出TPO 活性蛋白的存在，对照病毒感染上清中无TPO活性（见图6）。同样，两种重组痘苗病毒 hTPO的表达，在活性测定中无明显差异。
图6 重组痘苗病毒表达TPO的活性测定
Fig 6. Effects of hTPO secreted from recombinant vaccinia virus infected cells on proliferation of TPO dependent cell line
A. Culture medium of non-recombinant vaccinia virus infected cells；B.Culture medium of TPO recombinant vaccinia virusⅠinfected cells；C. Culture medium of TPO recombinant vaccinia viruseⅡ infected cells
讨 论
本文以研究hTPO在重组痘苗病毒的分泌表达为目的，成功地构建了TPO重组痘苗病毒。用以表达带有信号肽编码序列的完整hTPO基因，对重组病毒感染上清的免疫检测及活性测定结果表明：hTPO得以分泌性地表达于细胞无血清上清中，且具有特异性的生物学活性功能。由于重组痘苗病毒表达的hTPO与杆状病毒表达的相应产物在分子结构上会存在一定差异，因此，在Dot-ELISA检测中阳性对照的显色程度难以用作表达量的判定指标。
TPO重组痘苗病毒的构建，使获得接近天然hTPO蛋白分子的表达产物成为可能。而hTPO在无血清培养基中的分泌表达，更有利于表达产物的提纯，从而为更深入研究hTPO的蛋白性质提供了便利条件。重组痘苗病毒表达系统还可进一步应用于hTPO结构与功能的研究。
由于痘苗病毒在插入外源真核基因并予以表达的同时，重组病毒仍能保持完整的感染性。加之痘苗病毒本身具有强大的佐剂效应，能诱发针对所表达外源基因产物的抗体反应。因此，TPO重组痘苗病毒的构建为抗TPO的抗体制备提供了便利条件。为进一步的研究奠定了基础。
志谢：上海细胞生物学研究所裴钢教授惠赠cDNA文库, 北京赛因思生物技术研究所协助进行促TPO依赖细胞增殖活性测定工作，特此致谢。
本课题受国家863高科技生物领域及国家自然科学基金资助(编号：39525001)
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(收稿：1998-04-06 修回：1998-06-26)