AnnexinV/PI、TdT和PI法检测细胞凋亡的比较

AnnexinV/PI、TdT和PI法检测细胞凋亡的比较

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 检测技术

作者：黄健　沈永生　周宏平　郑俊年　王秀英

单位：江苏，徐州医学院附属医院中心实验室

　　检测细胞凋亡(APO)常用的有PI(碘化丙啶， propidium iodide)染色DNA的测定法和TdT(末端脱氧核苷转移酶， terminal deoxynucleotidyl transferase)法。AV(磷酯酰丝氨酸结合蛋白， Annexin)法是近年来提出的一种新方法。我们采用AV联合应用PI双参数法检测由地塞米松诱导小鼠胸腺产生凋亡细胞的百分率，并与上述二种方法作比较，以探讨其应用价值。

　　　　表1　3种方法检测凋亡细胞比率的结果(%,

　　注：1. 死亡=凋亡+坏死； 2. 均为配对t检验； 3. *与**相比较：P＜0.01; **与***相比较： P＜0.01; *与***相比较：P＜0.01 ; **与****相比较：P＞0.05

　　材料和方法

　　试剂：AV试剂盒，法国国际免疫公司产品，内含PI染液（250μg/ml)。TdT试剂盒，德国Boehringer Mannheim公司产品。自配检测DNA含量的PI(50μg/ml)染料。

　　流式细胞仪：FACS Calibur(美国BD公司)。

　　标本处理：取10只小鼠，分别于腹腔注射地塞米松25mg/kg，另取2只注射等量生理盐水作对照。10h后处死小鼠，开胸取胸腺，常规制备细胞悬液，调整细胞浓度为10⁶/ml备用。

　　实验方法

　　AV法测定：取10⁶个上述细胞用PBS洗涤、离心(2000r/5min)、去上清后按试剂说明操作。

　　DNA含量测定：取10⁶个细胞加入PI染液1ml放冰箱30min待测。

　　TdT测定法：取10⁶个细胞用1%的多聚甲醛冰浴固定15min，离心去上清，70%冷乙醇固定24h，然后按试剂说明书操作。

　　FCM检测：3种方法染色的标本分别上机检测，每次获取30000个细胞，保存数据后用Cell Quest软件进行分析。

　　结果与讨论

　　本实验3种方法检测小鼠胸腺细胞凋亡的结果见表1。流式细胞术检测细胞凋亡最早使用的是PI法，其结果是在正常的G0/G1峰之前有一亚二倍体峰。凡DNA含量小于二倍体的细胞均被认为是凋亡细胞。但Cohen等在实验中发现典型的凋亡形态并不一定伴有核小体间DNA降解及断裂^〔1,2〕。此外，郑泽铣等利用双激光双染色法证实了亚二倍体并不一定是凋亡细胞。因此利用PI法检测凋亡可能有很大的错检或漏检。本文结果也证实，PI法敏感性低、特异性差，故不适宜定量检测细胞凋亡。

　　TdT法是利用其介导荧光素标记的dUTP掺入到降解后DNA片段的3′羟基末端，根据掺入的荧光强度可定量细胞的凋亡率。据Mundle等报道，早期凋亡细胞易被TdT介导的dUTP标记，但是坏死期的细胞由于内源性核酸内切酶和蛋白酶的作用，DNA被切割为大小不等的片段，此时也会出现TdT法假阳性^〔3〕。本文TdT法的阳性率显著高于其它2组，表明其敏感性较高。它与AV法中死亡（凋亡+坏死）率之间差异无显著性，进一步提示TdT法的凋亡阳性率实际反映了细胞凋亡与坏死的总和，显示其特异性较差。王振义、陈竺等也证实DNA裂解并非凋亡所特有，因此，TdT法对凋亡的检测只能是选择性的，而不是特异性的。

　　对APO的进一步研究表明，各种细胞受到诱导后产生凋亡的初期，均会出现膜内外层面磷酯酰丝氨酸(PS)重新分布，即膜内表面的PS发生不可逆转的外露，其明显地早于核内DNA固缩、变性、裂解^〔4〕，检测外表面的PS，可了解凋亡的早期状况。Annexin-V与PS有较强的亲和力，具有钙依赖性。由于坏死细胞的PS也有外露现象，因此单纯利用荧光素标记的Annexin-V无法区分凋亡和坏死。必须联合应用可以进入破损细胞膜内与降解DNA结合的PI法，才能区分凋亡与坏死。本法根据膜的完整与否及PS的分布情况，可将待测细胞分为3群。AnnexinV^-/PI^-区活细胞、AnnexinV⁺/PI⁺区的继发性坏死细胞，AV和PI均高染、AnnexinV⁺/PI^-区的凋亡细胞群，AV的荧光强度高但PI强度低。其次，已有研究表明，小鼠胸腺细胞可自发产生凋亡。本实验显示PI结果为0，TdT法仅为1.24%，而AV法为13.12%。因此可说明AV法较其它方法敏感。此外，本法不需对细胞进行固定，从而可以去除其它方法因对细胞进行固定而造成的碎片增多或DNA片段丢失的不良影响。AV法试剂的价格适中，较宜进行大批量科研标本检测。

　　综上所述，不同方法定量APO的结果存在显著差异。AV法能检测早期的凋亡，可正确区分凋亡和坏死，实验中不需固定细胞，影响因素较少。因此，利用流式细胞术检测APO时，宜首选AnnexinV/PI双参数法。

参考文献

　　1，Oberhammer F, Wilson JW, Dive C, et al. Apoptosis death in epithelial cell: cleavage of the absence of internucleosomal fragmentation. Embo J, 1993, 12:3679-3684.

　　2，Cohen GM, Sun XM, Snowden RT, et al. Key morphologocal features of apoptosis may occur in the absence of internucleosomal DNA fragmentation. Biochem J, 1992, 286:331-334.

　　3，Mundle SD, Raza A. The two in situ techniques do not differentiate between apoptosis and necrosis but rather reveal distinct patterns of DNA fragmentation in apoptosis. Lab Invest, 1995, 72:611-613.

　　4，Vermes I, Haanen C, Reutelingsperger CPM. A novel assay for apoptosis: Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptoic cells using fluorescein labelled annexin V. J Immunol Methods, 1995, 180:39-51

(收稿日期：1999-07-12)